维生素D的测定方法
出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《食品添加剂分析检验手册》第236页（6750字）
一、维生素D2
化学名：9，10－开环麦角甾－5，7，10(19)，22－四烯－3β－醇(9，10－secoergosta－5，7，10(19)，22－tetraen－3β－al)
又名：麦角钙化醇；维生素D2
结构式：
分子式：C28H44O
相对分子质量：396．66
(一)维生素D2的鉴别
1．试剂和溶液
1．1 三氯甲烷。
1．2 乙酸酐。
1．3 硫酸。
2．鉴别方法
取本品约0．5mg，加三氯甲烷5mL溶解后，加乙酸酐0．3mL与硫酸0．tmL振摇，初显黄色，后渐变红色迅速变为紫色，最后成绿色。
(二)维生素D2含量测定
1．试剂和溶液
1．1 色谱纯试剂 正戊醇、正己烷、异辛烷。
1．2 2，6－二叔丁基对甲酚。
1．3 内标试剂 邻苯二甲酸二甲酯。
1．4 标准品 维生素D标准品，由卫生部颁发。
2．仪器
高压液相色谱仪。
3．测定方法
3．1 对照品贮备液的制备 称取维生素D2对照品25mg(准确至0．0002mg)，置于100mL棕色量瓶中，加异辛烷80mL，避免加热，用超声处理助溶1min使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存。
3．2 内标溶液的制备 精密取邻苯二甲酸二甲酯25mg，置25mL棕色量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。
3．3 样品溶液的制备 精密取供试品25mg，置100mL棕色量瓶中，加异辛烷80mL，避免加热，超声处理助溶1min使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀。精密量取上述溶液与内标液各5mL，置50mL棕色量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
3．4 系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷－正戊醇(994∶6)为流动相，检测波长为254nm，量取维生素D2对照品贮备液5mL，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1h，取出迅速冷却后，加正己烷5mL，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，将石英吸收池斜放成45°，在主波长为254nm和365nm的紫外线照射5min，使溶液中含有前维生素D2、反式维生素D2。维生素D2和速甾醇D2。取此溶液注入液相色谱仪中，测定维生素D2峰值，先后进样5次，相对标准偏差应不大于2．0%，前维生素D2(与维生素D2的比保留时间约0．5)与反式维生素D2(与维生素D2的比保留时间约为0．6)以及维生素D2与速甾醇D2(与维生素D2的比保留时间约为1．1)的峰分离度均大于1．0。
3．5 校正因子的测定 精密取对照品贮备溶液和内标溶液各5mL，置50mL棕色量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素D校正因子f1。精密取对照品贮备液5mL，置50mL棕色量瓶中，加入2，6－二叔丁基对甲酚结晶1粒，通氮排气后，密塞，置90℃水浴中加热1．5h，取出迅速冷却至室温，精密加内标溶液5mL，加正己烷至刻度，摇匀，取一定量注入色谱仪，计算校正因子。
f2=(4s×mr－f1×ms×Ar1)／(Ar2×ms) (9－42)
式中 f2——前维生素D2折算成维生素D2的校正因子
As——内标的峰面积
mr——加入对照品的量，g
f1——维生素D2的校正因子
ms——加入内标物质的量，g
Ar2——维生素D2的峰面积
Ar2——前维生素D2的峰面积
3．6 含量测定 按高效液相色谱法中的内标加校正因子测定法(《中华人民共和国药典》1990年版二部附录68页)测定，取样品溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图，测量峰面积。
4．分析结果的表述
x=(f1·Ai1+f2·Ai2)ms×100／(As·m) (9－43)
式中 x——维生素D2及前维生素D2折算成维生素D2的总含量，%
Ai1——维生素D2的峰面积
Ai1——前维生素D2的峰面积
m，——加入内标物质的量，g
As——内标的峰面积
m——样品质量，g
f1——维生素D2的校正因子
f2——前维生素D2折算成维生素D2的校正因子
5．允许差
本方法平行测定的允许绝对差在1．5%之内。
二、维生素D3
化学名：9，10－开环胆甾－5，7，10(19)－三烯－3β－醇。又名维生素D3，胆钙化醇结构式：
分子式：C27H44O
相对分子质量：384．65
(一)维生素D3的鉴别
见维生素D2。
本品的红外吸收图谱应与对照的图谱(光谱集453图)一致。
(二)维生素D3含量测定
精密称取本品25mg，置100mL棕色量瓶中，加三甲基戊烷80mL，勿加热，超声助溶1min，全溶后加三甲基戊烷定容，摇匀，为供试液。接维生素D2测定。
三、食品中维生素D的测定
(一)高压液相色谱法
1．原理
测定食品中的脂溶性维生素时，先将样品皂化，由酯型转化为游离型，再进行测定。
2．试剂和溶液
2．1 乙醚 不含过氧化物，用重蒸馏的乙醚(去初馏液和尾馏液各10%)。
2．2 乙醇(95%，分析纯)。
2．3 甲醇(分析纯)。
2．4 无水硫酸钠。
2．5 50%氢氧化钾溶液。
2．6 焦性没食子酸。
2．7 维生素D标准(MERCK) 称取5．3mg标准品，用少量乙醇溶解后用甲醇定容至50mL，即为106μg／mL的标准液，再取1mL定容至25mL，即为4．24μg／mL的HPLC外标液。
3．仪器
3．1 高压液相色谱仪。
3．2 直型K－D浓缩器。
3．3 磁力加热搅拌器。
4．测定方法
4．1 皂化 取5～10g样品，加1g焦性没食子酸，50mL95%乙醇溶液，在磁力搅拌下使样品均匀溶解后加入30mL50%氢氧化钾溶液，在(50±2)℃下搅拌回流40min。
4．2 提取 取下回流液，冲凉后用50mL，30mL，20mL，20mL乙醚萃取，合并乙醚层，用水洗至中性，过无水硫酸钠，在50℃下浓缩至约5mL取下后，用甲醇定容至10mL，待测定。
4．3 测定 带紫外鉴定器的高压液相色谱仪，μ－Bon dapak C18(30cm×3．9mm)柱，流速0．8mL／min，流动相为甲醇，进样量20μL，在波长265nm下测定。
5．分析结果的表述
式中 S——标准峰面积
S′－－样品峰面积
A——样品稀释倍数
ρ——标准浓度，μg／mL
(二)三氯化锑比色法
1．原理
维生素D与三氯化锑在三氯甲烷中产生橙黄色，并在波长500nm下有一个最大吸收度。显色的强度与维生素D含量成正比，可以比色定量。加入乙酰氯可以消除温度、湿度等于扰因素。维生素D与维生素A共存时，须先用柱层析分离，去除维生素A，再比色测定。
2．试剂和溶液
2．1 三氯化锑。
2．2 氯仿。
2．3 三氯化锑－氯仿溶液 取一定量的重结晶三氯化锑，加入其重量5倍体积的氯仿，振摇。
2．4 三氯化锑－氯仿－乙酰氯溶液 取上述三氯化锑－氯仿溶液，加入其体积3%的乙酰氯，摇匀。
2．5 乙醚。
2．6 乙醇。
2．7 石油醚(沸程30～60℃)。
2．8 维生素D标准溶液 称取0．25g骨化醇，用氯仿稀释至100mL(100000IU／mL维生素D2)。临用时，用氯仿配制成1－100IU／mL的标准使用液。
2．9 聚乙二醇(PEG)600。
2．10 白色硅藻土Celite545。
2．11 氨水。
2．12 无水硫酸钠。
2．13 0．5mol／LKOH溶液。
2．14 氧化铝(中性，层析用)。
3．仪器
3．1 分光光度计。
3．2 层析柱 内径22mm，具活塞，砂芯板。
4．测定方法
4．1 样品处理 同维生素A三氯化锑法。
4．2 皂化和提取 同维生素A的三氯化锑法。
4．3 纯化 当维生素D与维生素A共存时，必须进行纯化步骤，分离维生素A。若无维生素A等干扰物存在，可省去此步骤而直接测定。
4．3．1 分离柱的制备：称取15g Celite 545，移入250mL碘价瓶中，加入80mL石油醚，振摇2min，再加入10mL聚乙二醇(PEG)600，激烈振摇10min，使其粘合均匀。装柱顺序为1g无水硫酸钠、粘合物、5g中性氧化铝及少许无水硫酸钠。轻轻转动层析柱，使柱内的粘合物高度保持12cm左右。
4．3．2 纯化：柱装填后先用30mL左右的石油醚进行淋洗，然后将上述提取样液倒入柱内，再用石油醚继续淋洗，弃去最初收集的10mL，再用200mL容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗液流速为2～3mL／min。
将淋洗液放入250mL分液漏斗中，加入过量的水重复振摇1次，弃去水层(水洗去除残留的聚乙二醇，如果它存在，会与三氯化锑形成混浊，影响测定)。
将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水，移入三角烧瓶或脂肪瓶中，在水浴上浓缩至约5mL。在水浴上减压至恰干，立即加入5mL氯仿于10mL具塞量筒内，摇匀，待测定用。
4．4 测定。
4．4．1 标准曲线的绘制：分别吸取维生素D标准工作液(浓度按样品中维生素D含量高低而定)0．0，1．0mL，2．0mL，3．0mL，4．0mL，5．0mL于10mL容量瓶中，用氯仿定容，摇匀。
分别吸取上述标准溶液各1mL于1cm比色皿中，置于分光光度计比色槽内，立即加入三氯化锑－氯仿－乙酰氯溶液3mL，在波长500nm下，在2min内进行比色测定，根据测得的各标准溶液的吸光度，绘制标准曲线。
4．4．2 样品测定：吸取纯化的样品溶液1mL于1cm比色皿中，以下操作同4．4．1。根据测定样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出其相应的含量。
5．分析结果的表述
式中 ρ——从标准曲线上查得维生素D浓度，IU／mL
V1——定容体积，mL
V2——测定时取样液的量，mL
m——样品质量