嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤的实验研究
出处：按学科分类—医药、卫生 中山大学出版社《脊髓损伤》第524页（11990字）
1994年Kott等将胚胎嗅球移植入新生大鼠深部脑组织中，结果证实嗅鞘细胞能够在大鼠体内存活并能包绕非嗅觉神经元。这一研究开创了嗅鞘细胞移植治疗神经通路损伤的先河。自从这项研究后，大量的将嗅鞘细胞移植于神经系统不同部位的试验研究相继而来，并取得了令人振奋的结果。以前的研究已经证实，中枢神经系统的轴突在雪旺氏细胞环境中很容易再生，但是，这些神经轴突从雪旺氏细胞环境中重新长入宿主中枢神经系统中并且要与宿主中枢神经系统中目标神经元形成新的功能性突触时则出现了问题，而功能性突触的形成以及由此产生的神经功能的恢复无疑是临床应用的最终目标。研究发现，移植雪旺氏细胞以后很多因素在起作用，以至于阻止再生的神经轴突穿过移植体与宿主中枢神经系统之间的界限而进入宿主中枢神经系统中。这些因素包括相互不识别、反应性增生的星形胶质细胞和少突状胶质细胞的前体细胞所表达的对轴突再生有害的多种硫酸软骨素蛋白多糖以及与髓磷脂相关的抑制因子Nogo-A和MAG的表达等。实际上，雪旺氏细胞能够加剧星形胶质细胞增生和使CSPGs的表达增加。但是，如果移植体与宿主中枢神经的过渡区像嗅觉系统，那么这种两者接触面之间的抑制特性就会被克服。为了证明这一点，Ramo’n-Cueto等将嗅鞘细胞添加到雪旺氏细胞移植体的两端，再将其移植进入大鼠的脊髓损伤模型中，如图22－11所示。其结果显示有更多的再生轴突穿过了移植体与宿主中枢神经之间的边界，以至于有更多的再生神经轴突长入了移植体以及重新进入宿主中枢神经系统中。是什么因素使得再生轴突穿过了移植体与宿主中枢神经系统的临界部位呢?毫无疑问嗅鞘细胞是其中的一个重要因素。Li等人将嗅鞘细胞移植于脊髓组织部分横断的大鼠动物模型中，结果发现嗅鞘细胞促进了再生轴突长入宿主的脊髓组织中，并且为再生轴突的继续生长创造了一个良好的环境。但是如果从临床角度观察，再生轴突的数量没有太大的意义，重要的是有神经功能的恢复，Ramon-Cueto等的研究得出了令人兴奋的结果：嗅鞘细胞移植进入脊髓完全横断的大鼠动物模型中发现有运动功能的恢复。Li等的试验也证实了嗅鞘细胞移植可以促进皮质脊髓束功能的恢复。大量的试验已经证明嗅鞘细胞是优于雪旺氏细胞的治疗脊髓损伤的移植细胞。嗅鞘细胞是否能使神经轴突形成髓鞘或简单的包绕神经轴突决定于轴突的直径。在正常的嗅觉系统中，嗅鞘细胞简单包绕轴突的阈值远低于使神经轴突形成髓鞘的阈值。那么，如果移植的嗅鞘细胞遇到非嗅神经，它是否会像雪旺氏细胞一样使其形成髓鞘?Devon等用组织共培养系统证明，嗅鞘细胞在形态上和生物学行为上与雪旺氏细胞相似。接着Franklin等将纯系嗅鞘细胞移植入成年大鼠的顽固性脱髓鞘区域，使脱髓鞘的神经轴突获得了髓鞘。这一试验用纯系的嗅鞘细胞排除了髓鞘生成是其他胶质细胞，如雪旺氏细胞作用的可能性。随之又有研究证实嗅鞘细胞所形成的髓鞘增进了神经冲动的传导。这种使脱髓鞘的神经轴突重新获得髓鞘的特性使得嗅鞘细胞不仅成为治疗脊髓损伤的研究热点，而且也成为治疗脱髓鞘疾病，如多发性硬化综合征的研究热点。虽然雪旺氏细胞和少突状胶质细胞移植后可使神经轴突获得髓鞘已经在很多实验室的脱髓鞘疾病动物模型中被证实，但现在的关键问题是将此过程应用到临床。简单地说，少突状胶质细胞虽然可以使移植区脱髓鞘的轴突广泛地形成髓鞘，但它的前体细胞很难从人的中枢系统中得到。雪旺氏细胞，虽然从成人的外周神经系统中得到相对容易，但将它应用于慢性的以胶质瘢痕形成为特征的脱髓鞘疾病中则不能使脱髓鞘的轴突广泛地形成髓鞘。嗅鞘细胞可从成人的嗅粘膜固有层和神经外科手术切除的嗅球中培养获得，尤其是人胚嗅鞘细胞培养的成功，解决了嗅鞘细胞临床应用的来源问题。并且，嗅鞘细胞可使移植区的脱髓鞘的神经轴突在大量的有星形胶质细胞形成的瘢痕的情况下广泛地获得髓鞘。这是因为，首先，在嗅球的嗅神经层中嗅鞘细胞和星形胶质细胞紧密相接，这种情况是从来没有在雪旺氏细胞和星形胶质细胞间观察到的，虽然在受损伤的脊髓组织中嗅鞘细胞和星形胶质细胞的这种相容性可能发生改变。其次，当雪旺氏细胞和嗅鞘细胞分别于星形胶质细胞共同培养时，它们之间的相互作用互不相同，嗅鞘细胞同星形胶质细胞互相混合在一起，而雪旺氏细胞和星形胶质细胞则彼此分开。再者，嗅鞘细胞移植入中枢神经系统以后在其中迁移的距离远远超过雪旺氏细胞。如前面所提到的，无论是从组织培养还是从形态学的研究中都发现嗅鞘细胞有多种外观。在移植促进神经轴突再生和治疗脱髓鞘疾病的实验中至少观察到两种形态的嗅鞘细胞：一种是能使脱髓鞘的轴突重新形成磷脂髓鞘的雪旺氏细胞样的嗅鞘细胞，另一种则被描述为星形胶质细胞样或脑膜细胞样。虽然还没有足够的证据证实，但现在倾向于认为，能够形成磷脂髓鞘的是表达P75神经营养因子受体的雪旺氏细胞样的嗅鞘细胞，而另一种星形胶质细胞样嗅鞘细胞则在培养时表达胚胎性的NCAM。这种形态上的差异反映在功能上是否有差异在正常的嗅觉系统中尚不清楚，但这可能对于移植嗅鞘细胞治疗神经系统疾病是有指导意义。移植嗅鞘细胞无非是为了改变损伤以后局部的微环境以使神经轴突再生，所以用何种形态的嗅鞘细胞移植需要仔细考虑。因为有的嗅鞘细胞可以使神经轴突形成髓鞘，而有的则是形成神经束膜样的鞘包绕它们。当我们的目标是使脱髓鞘的轴突重新获得髓鞘时，非纯系的嗅鞘细胞则会降低轴突髓鞘再生的效率，因为其中那些与轴突联系紧密嗅鞘细胞不能形成髓磷脂鞘。现在困扰生物学家的一个关键问题是，在嗅鞘细胞移植前的表型能决定它在损伤的中枢神经微环境中的作用，还是移植后微环境的作用使得嗅鞘细胞发生形态上的改变。沈慧勇等为观察嗅鞘细胞对脊髓轴突再生的促进作用，将分离、纯化与体外培养2周的SD大鼠嗅鞘细胞，移植于12只成年SD大鼠第10胸椎横断模型的脊髓两断端；8只对照动物注入DMEM／F12培养基。移植后2周和8周进行神经嗜银染色与髓磷脂碱性蛋白(MBP)组织化学和神经生长因子受体(NGFR)免疫组织化学研究。其结果为嗅鞘细胞移植组2周后脊髓两端在形态学上呈现初步愈合现象；组织学观察显示，移植嗅鞘细胞与损伤脊髓组织整合良好，再生轴突长入断端组织，8周时再生轴突检查明显增多，嗅鞘细胞与再生轴突均呈MBP和NGFR阳性表达。对照组两断端液化坏死，轴突变性，未见再生轴突。
图22－11 嗅鞘细胞移植促进再生轴突穿过雪旺氏细胞移植体
脊髓挫伤由于神经组织的逐步丢失而导致大的空洞的形成，结果控制肢体运动的下行纤维束部分或全部被破坏，Giles W等利用嗅鞘细胞移植的方法促进与指导神经再生而修复挫伤的脊髓节段。组织病理学分析表明人类的脊髓损伤大约有40%是挫伤。鉴于脊髓损伤中挫伤的高发生率，研究移植嗅鞘细胞对脊髓挫伤的修复作用非常必要。Hill等的研究证实在成年脊髓挫伤以后，血细胞和一些炎症细胞很快侵入损伤区。在接下来的几个星期，这些细胞消失，一个纺锤状的、充满液体的被损伤区周围的白质所包绕的囊腔形成。也许这些血细胞和炎症细胞的存在对于移植于挫伤区的嗅鞘细胞有不利的作用。为了确定嗅鞘细胞移植治疗脊髓挫伤的最佳时机(移植时间)和最佳环境(不同的移植组合)，Giles W等按照移植时间和移植物的不同组合将实验大鼠分为7组：①损伤后30分钟移植，移植物为嗅鞘细胞加纤维蛋白，记为0d／OEC-fibrin；②损伤后30分钟移植，移植物为嗅鞘细胞，记为0d／OEC-medium；③损伤后30分钟未进行任何移植，记为0d／contusion only；④仅做椎板切除未做脊髓挫伤，记为0d／laminectomy only；⑤损伤后7天移植，移植物为嗅鞘细胞加纤维蛋白，记为7d／OEC-fibrin；⑥损伤后7天移植，移植物为嗅鞘细胞，记为7d／OEC-medium；⑦损伤后7天移植，移植物仅为培养基，记为7d／medium only。实验者在损伤后两个月，在脊髓损伤区的尾侧注射逆行性示踪剂Fluorogold，用免疫组织化学的方法观察轴突的再生及对脊髓组的保护情况。其结果如下：在损伤后8周，在0d／contusion only和7d／medium only对照组损伤的脊髓组织有单个的大的充满液体的囊腔，从囊腔的头端到尾端大约在1～5mm之间，如图22－12所示。在所有的移植嗅鞘细胞的组中，不管是30分钟后还是7天后，8周时损伤区含有大量的细胞和少量的囊腔，如图22－12B－E所示。除了细胞以外，还可以看到成束的组织桥通过移植区，如图22－12B所示。总的来说，在延迟性移植组(7d)，如图22－12D所示，移植物与损伤区脊髓组织融合较好(与0d移植组相比)，如图22－12B、C所示。嗅鞘细胞移植对脊髓组织的保护作用通过在一个2．5mm的脊髓节段中(包括损伤中心)从总的像素中减去损伤区的像素的方法来评估，其值被表示为百分比。其结果如下：在7d／medium only对照组，脊髓组织被保存了整个观察节段的54．4±3．8%。在0d／OECmedium和0d／OEC-fibrin组，其值分别为72．8±2．1%和65．7±4．1%。而7d／OEC-medium和7d／OEC-fibrin组，其值分别为70．3±2．3%和68．1±1．3%，如图22－13所示。统计学分析显示示移植嗅鞘细胞组与仅注射培养基的对照组其值有显着性差异(P＜0．05)。实验结果证实在脊髓挫伤后即刻及－周后移植嗅鞘细胞对损伤脊髓有保护作用。在本试验中Giles W等对各组进行了各种免疫组织化学染色，以显示在脊髓挫伤区不同细胞的存在情况。在染色的过程中没有发现非特异性的染色。在0d／contusion only和7d／medium only对照组GFAP阳性的星形胶质细胞存在于充满液体的囊腔的周围脊髓组织中。在所有的对照组大鼠中囊腔的头端边界的灰质中含有许多5－HT阳性的神经轴突。CGRP阳性的感觉神经元和5－HT阳性的神经元被发现存在于移植区的尾侧和腹侧的白质中。另外，还有一小部分5－HT阳性的神经元存在于囊腔的尾端，但其距离囊腔尾端的距离不超过3～4mm。在移植嗅鞘细胞的实验组中其免疫组织化学染色非常相似。在损伤中心位置有GFPA、P75和S100阳性的细胞，这些都是嗅鞘细胞的表面标志。但Takami等人认为这种细胞也可能是从邻近节段的脊背神经根处迁移而来的雪旺氏细胞，因为雪旺氏细胞同样具有以上表面标志。在移植嗅鞘细胞组的所有的大鼠中，GFPA阳性细胞与P75阳性的细胞在移植区混合在一起，这些GFPA阳性细胞被认为是星形胶质细胞而不是嗅鞘细胞，因为它们有着高密度的染色。在移植区，P75阳性的细胞表现出典型的纺锤状、双极的形态。在所有的移植嗅鞘细胞的大鼠中，P75阳性的细胞仅存在于损伤区及其四周200～400μm厚度范围内的脊髓组织内，在更远的脊髓组织中没有发现该种细胞存在。RT97阳性和GAP43阳性的神经轴突存在于移植区内，这些神经轴突与GFPA、P75和S100阳性的细胞紧密排列在一起。在7d／OEC-medium和7d／OEC-fibrin组中RT97阳性的神经轴突的数量明显多于0d／OECmedium和0d／OEC-fibrin组。在所有实验组在移植区周围的白质中的GFPA阳性的神经轴突明显多于对照组。CGRP阳性的感觉神经轴突被发现存在于移植区以及背侧存活的脊髓白质中。所有的嗅鞘细胞移植组都发现有5－HT阳性的神经元存在，并且这些神经轴突中的一部分从移植区的头端进入移植区周围的白质组织中，另一部分则穿过了移植物。这些5－HT阳性的神经轴突都超过了移植区尾端而进入宿主的脊髓组织中，特别是在7d组，轴突最远可以距离移植区尾端20mm，这在对照组仅有3～4mm。该实验还用注射FG(Fluorogold)逆行性示踪的方法在整个大脑、红核和3个脑干核(网状结构、前庭核、中缝核)中来观察轴突穿过移植物并到达其尾端的上运动神经元(脊神经)的数量。结果在所观察的所有部位都发现有FG标记的神经元的存在。图22－14给出了部分组在红核中的FG标记的神经元的情况。图中可见在A中(control)FG标记的神经元的数量非常少，但在B～E(嗅鞘细胞移植组)中则可见到明显增多的FG标记的神经元。具体结果如下：在0d／contusion only和7d／medium only对照组中FG标记的神经元的平均数量(单位为个)分别为1391±126和1456±133。在这两个对照组整个大脑中和各个核中FG所标记的神经元的平均数量没有明显差异。需要指出的是在1周后仅注射培养基不能起到保护下行神经轴突或促进下行神经轴突再生的作用。在0d／OEC-medium和0d／OEC-fibrin组FG所标记的神经元的平均数量分别为2972±311和1610±206。0d／OEC-medium组中FG所标记的神经元的平均数量是对照组中数量的2倍左右，此组中网状脊髓束神经元明显比对照组增多。总的来说，在0d／OEC-medium中FG所标记的神经元的平均数量要高于0d／OEC-fibrin组。在7d／OEC-medium和7d／OEC-fibrin组中FG所标记的神经元的平均数量分别为2985±494和2814±442，在数量上比对照组分别增加了109%和98%。这两组在网状脊髓束、前庭脊髓束和红核脊髓束中FG所标记的神经元的平均数量明显高于对照组。总之，7d／OEC-medium中FG所标记的神经元的平均数量要高于7d／OEC-fibrin和0d／OEC-medium组。以上结果说明，移植嗅鞘细胞，特别是延迟性移植(7天)，可以促进脊髓上运动神经元的再生，如图22－15所示。该实验同时也对实验大鼠的后肢的运动功能的恢复根据BBB试验评分法作了评估。在脊髓损伤以前，所有的大鼠按BBB评分法都得到了21分的最高分。在0d／contusion only组脊髓损伤后1天BBB评分降至0，然后在损伤后8周逐渐增加到11．7±0．2。在7d／medium only组损伤后8周BBB评分为10．3±0．1。损伤后8周在0d／OEC-medium和0d／OEC-fibrin组中BBB评分分别增至11．5±0．2和10．8±0．4。7d／OEC-medium组最终的BBB评分为13．9±0．7，而7d／OEC-fibrin为12．2±0．4。用ANOVA统计学分析方法可以得出如下结论：7d／OEC-fibrin组的BBB评分与7d／mediumonly对照组在1周(P＜0．05)和6周(P＜0．05)时存在明显差异；7d／OEC-medium组的BBB评分与7d／medium only对照组在3天(P＜0．02)、1周(P＜0．02)、6周(P＜0．01)、7周(P＜0．05)以及8周(P＜0．001)时的差异都有显着的统计学意义。以上实验所得到的数据对嗅鞘细胞移植修复人类脊髓挫伤有着重要的指导作用。黄红云等为研究嗅鞘细胞在脊髓挫裂损伤后不同时期植入能否帮助轴突再生、穿过瘢痕和神经功能恢复，用NYU打击器制造大鼠的脊髓挫裂损伤模型，在伤后即刻和2周后植入嗅鞘细胞，采用BBB方法做行为学观察3个月，经运动皮层注入神经示踪剂(BDA)后行组织化学染色，其结果为部分大鼠嗅鞘细胞植入后比对照组的神经功能恢复好，组织学发现这些神经功能恢复好(BBB分数＞10)的大鼠，再生神经轴突能穿过损伤瘢痕区到达损伤下段。目前脊髓损伤方法多采用半切、横切和皮质脊髓束局部损害等模型。在脊髓半切或横切损害中，单核吞噬细胞、嗅鞘细胞移植和IN－1抗体等方法，均能促使损伤神经轴突再生，穿过损伤区瘢痕和促使部分脊髓神经功能恢复，但这些方法在脊髓挫裂损伤模型中未必能达到相同结果。应用IN－1抗体在脊髓半切损伤模型中具有帮助神经轴突再生和神经功能恢复的作用，而在脊髓挫裂损伤模型中几乎没有这种帮助作用。胚胎脊髓组织移植在脊髓挫裂损伤模型中能促使部分脊髓神经功能恢复，但缺乏组织学上神经轴突再生和穿过损伤区瘢痕的证据，且也引起医学伦理的争议。以上述脊髓损伤模型作为基础研究，所取得的成果具有重要的价值和意义。然而这类模型与临床脊髓挫裂损伤的实际情况差距太大，很难以此结果为根据进行临床应用试验。为了奠定临床病人治疗试验的基础，此实验模拟临床脊髓挫裂伤的情况下，在脊髓挫裂伤后即刻和伤后两周将嗅鞘细胞移植到损伤区。结果显示嗅鞘细胞在伤后即刻和伤后两周移植均能促进神经轴突再生和穿过损伤瘢痕区到达损伤下段，并恢复损伤神经的部分功能。神经功能恢复与组织学发现的损伤下段再生神经轴突相吻合。这一研究成果的重要意义在于脊髓挫裂损伤晚期受损神经轴突仍有再生和神经功能恢复的能力，这为临床脊髓损伤病人的治疗带来一线希望。另外他认为即使异体嗅鞘细胞移植，根据本实验结果，也无必要长期应用免疫抑制剂。如前所述，当中枢神经损伤时，少突状胶质细胞因损伤而死亡，星形胶质细胞增生，巨噬细胞受到刺激侵入，充满雪旺氏细胞的囊腔形成，以及非神经性的成纤维细胞、结缔组织、渗出物、神经碎片聚集于损伤区，所以神经的再生几乎是不可能的一点都不奇怪，仅仅通过提供神经营养因子是不可能克服抑制神经再生的因素，使得原来的神经通路得以修复。上个世纪或更长的时间神经再生研究的首要目标就是重建损伤后局部的微环境，以致于使受损的神经通路得以恢复。这其中包括了胶质细胞移植。根据Cajal的建议，Aguayo等的研究最初表明雪旺氏细胞可以诱导受损的中枢神经元轴突的生长，并可使其穿入雪旺氏细胞移植物。但研究很快发现，几乎没有再生的神经轴突穿越雪旺氏细胞移植体进入宿主中枢神经系统。对嗅觉系统的研究表明嗅鞘细胞对正常情况下嗅神经的再生有重要的作用。并且关于嗅鞘细胞移植的试验研究也发现嗅鞘细胞在损伤的中枢神经系统中表现出与雪旺氏细胞不同的特点：①它可以在宿主中枢神经系统中迁移更远，并且与宿主中枢神经系统中的胶质细胞融合良好；②它可以抑制受损神经轴突侧芽分支的生长，并能快速地诱导它们穿越嗅鞘细胞移植区，进入宿主中枢神经系统中。现在的研究也表明嗅鞘细胞移植可以促进受损的功能的恢复。那么它的机制到底是什么呢?Y．Li等在其综述中这样描述，很明显，受损的背侧的皮质脊髓束的功能不可能由损伤平面以上的同侧的再生神经轴突或与腹侧皮质脊髓束错误相连的再生神经轴突来重建，也就是说，背侧皮质脊髓束的功能只能由其再生轴突穿越损伤区并与同侧的皮质脊髓束的神经元发生突触来建立。但嗅鞘细胞促进背侧皮质脊髓束神经轴突再生的机制还没有完全弄清楚。因为现在已有的证据还不能证明嗅鞘细胞移植后穿越移植体的新生的神经轴突是否真正长入了原来的神经通路中。Davies等人的研究也证明即使受损的扣带回中新生的神经轴突到达了原来的正常时的神经通路时也不能长入其中，这表明在成年中枢神经系统神经通路中存在抑制或缺乏促进神经再生的因素。所以，在再没有任何证据证明再生轴突远端的命运到底如何以前，我们不可以否定这种学说——穿越移植体进入宿主中枢神经系统的再生轴突，可能就在刚刚穿越后终止生长。并且有研究表明中枢神经系统损伤后在损伤周围以及损伤区都有大量的新生的神经芽，这些神经芽可与再生轴突快速而容易地形成突触，从而阻止再生轴突的继续生长。可能这些突触还要进行一系列的重构，从而使损伤的中枢神经系统的功能有可塑性。Y．Li等推测在皮质脊髓束靠近移植区所形成的轴突促进了功能的恢复，但这些连接在分布上是不正常的，要使大鼠将这些错误指导的信息合并成正常的功能必须进行一系列的功能的重新调整。在皮质脊髓束损伤的大鼠移植嗅鞘细胞后，功能的恢复开始于1周，到两周时基本完成，在这短短的时间内再生神经轴突不可能穿越很长的距离，这也支持了上面论点的正确性。上面的观点只是假设，缺乏充分的证据。但是如果突触真的在一周内有效地形成，并且通过滤除那些分布异常的突触连接的信息重建而导致功能的重构、恢复，那么中枢神经系统可塑性的概念则要比Raisman第一次观察到1周内部分去神经的中缝核突触形成时所提出的概念高一个层次。我们希望如此，因为毕竟塑性是中枢神经系统的一种功能，也是为了适应和竞争所导致的进化的原动力。
图22－12 嗅鞘细胞移植促进神经再生和缩小囊腔的形成(图中的星号代表损伤区域，图B中的箭头表示组织桥通过损伤区域，图C和E中的箭头表示少量的小囊腔)
图22－13 脊髓组织保护度直方图星号示有显着性差异(P＜0．05)
图22－14 嗅鞘细胞移植后红核中FG标记的神经元数量增加
图22－15 嗅鞘细胞移植促进脊髓上运动神经元再生直方图
上段颈髓损伤的一个灾难性的后果就是呼吸功能的丧失。在临床上，这样的病人只能通过人工辅助通气来维持其生命。直到现在还没有修复呼吸通路损伤的可行性方法。Ying Li等试图通过移植嗅鞘细胞的方法来恢复上运动神经元对呼吸的控制和肢体的运动功能。他们移植嗅鞘细胞的方法不同于上面所述。他们将将嗅鞘细胞接种于35mm的平板上培养14～17天，这时嗅鞘细胞会产生足够的基质(大约20μm厚)，以致于使其埋于其中；然后用聚乙烯刀片将其刮出，使之形成一个5mm3大小的团块，再将其分为4～5份，用小镊子直接移植到脊髓损伤区域，每份基质－嗅鞘细胞大约可以填充4mm2的损伤区域。这种方法可更有效地移植嗅鞘细胞到损伤区域并且更有效地将嗅鞘细胞保留于损伤区。因为，它减少在以前的方法中移液过程所浪费的修桥细胞量以及移植后嗅鞘细胞向四周扩散。在第3颈髓节段以上的脊髓横断可切断呼吸通路，使得位于第3到第5颈髓节段腹侧灰质中的控制膈肌运动的神经元失去了节律性冲动的支配。从实际的观点出发，由于因完全横断而导致的呼吸功能完全丧失的动物模型需要不间断的人工通气，并且存活率很低，因此，Ying Li等只切断大鼠的一部分呼吸通路，而保留足够维持大鼠呼吸功能的呼吸通路。由于呼吸通路是左右对称的，所以可以横向切断C3平面以上一半的脊髓组织，使同侧的膈神经及膈肌的功能丧失而对侧却保留。移植后2个月，大鼠被深麻醉，持续血压监护，气管内插管，然后暴露损伤侧的膈神经，将其浸泡温暖的石蜡油后，放置在双极钨电极板上记录膈神经的复合动作电位。在记录大鼠自主呼吸的动作电位时，给其应用神经肌肉阻滞剂使其瘫痪。这种处理避免了任何可能的外周来源的冲动输入(比如说来源于对侧膈神经)，确保了所有记录到的膈神经的复合动作电位都是中枢来源的。为了刺激脑干呼吸中枢神经冲动的最大输出，暂停通气20～50秒记录膈神经的动作电位。为了保证我们的试验条件不会致使仅损伤而没有移植嗅鞘细胞的大鼠潜在的交叉呼吸通路发出神经冲动，所以在移植组所记录到的膈神经动作电位的增加完全是因为嗅鞘细胞的移植。每只大鼠脊髓损伤面积的大小用组织切片的方法鉴定。在仅做了横切而没有移植嗅鞘细胞的23只大鼠中，有14只为完全性脊髓半切。所有这14只大鼠损伤侧的膈神经的动作电位不能够被记录到。其余的9只大鼠组织切片证实半切不完全，即只切断脊髓外侧和背侧的部分，但脊髓的腹侧的部分被保留。在这9只大鼠中膈神经的动作电位是可以测得的，这与Feldman等所证实的呼吸通路主要位于脊髓的腹侧部分是一致的。移植嗅鞘细胞的24只大鼠被组织切片法证实都未完全性横切，在这些大鼠其中有19只可记录到膈神经的动作电位，如图22－16所示。Ying Li等也研究了大鼠肢体功能的恢复。在该实验中让大鼠爬一条倾斜的(与垂线的夹角为15°)，长1m的网格栅。爬这样的网格栅对于大鼠来说是一种自发的反应，不需要强迫或奖赏。正常的大鼠很容易地完成这样的爬行活动，四只爪都能准确地握到网格栅中的短棒。而在损伤后的大鼠损伤侧的前爪和后爪抓握网格栅中的短棒时表现出不同的困难程度，大鼠的前爪伸过短棒而插入网格中的深度由手腕到腋窝有所不同。大鼠感觉到了前爪的过伸，然后缩回前爪，它不断地试探直到前爪能够抓握到短棒为止。大鼠前爪的错误定位用分数的形式被记录下来：过伸到腕记为1分，过伸到肘记为2分，而到腋窝记为3分。所观察到的结果为：在损伤后10～20天就可以看到肢体功能的恢复，在嗅鞘细胞移植组肢体功能的恢复明显快于仅损伤组。在损伤后3周以后，每只大鼠前爪错误定位所得的分数在接下来的6周的测试时间里没有明显的变化。被组织切片的方法鉴定为完全性半切的14只大鼠，6周测试时间中每周总分平均为226±18．5只保留有脊髓腹侧部分的大鼠的功能缺陷不是太严重，其6周测试时间中每周总分平均为79±15。在23只嗅鞘细胞移植的大鼠中(完全性横断)，其6周测试时间中每周总分平均为55±7。没有发现移植组中的大鼠肢体功能恢复到正常对照组的水平。值得指出的是，在评价其功能恢复的结果时，我们必须承认大鼠脊髓损伤和人类的脊髓损伤是有区别的，并且在人和大鼠，脊髓损伤后功能的恢复可以自然地发生，而且不用修复手段的干预，仅用康复疗法就能促进其恢复。所以嗅鞘细胞移植不是促进脊髓损伤功能恢复的惟一原因。无论是移植组还是非移植组，在损伤后的前10天肢体的运动功能都有明显的恢复。其原因可能是水肿的减轻、神经碎片的清除、新生血管的生长、去神经部位新的神经突连接的形成以及这些连接的重建。此实验的研究结果表明嗅鞘细胞移植可以促进脊髓两种互相无关系的功能同时恢复。
图22－16 损伤侧膈神经运动电位的记录(在A．B、C中灰色的部分代表横切的面积，每只大鼠横切的最远的边界已经被标了出来。星号代表没有横切的脊髓腹侧部分。D表示电生理记录值。左边的一栏为自主呼吸下的记录，右边的一栏为使用肌松剂和20～50秒窒息时的记录)
Marc J．Ruitenberg等用腺病毒作为载体将编码脑源性神经营养因子(BDNF)以及神经营养素－3(NT－3)的基因转导入嗅鞘细胞内，然后使转化的嗅鞘细胞移植到颈髓损伤的大鼠中，观察其是否能够促进损伤神经轴突的再生和保护濒临死亡的损伤周围的神经。试验将大鼠分为Adv-LacZ组、Adv-BDNF组、Adv-NT－3组、Adv-BDNF与Adv-NT－3共同移植组以及非移植组。损伤后4个月，所有嗅鞘细胞移植组损伤面积都比非移植组小，尤其是Adv-BDNF组、Adv-NT－3组、AdvBDNF与Adv-NT－3共同移植组损伤面积更是显着缩小。所有的嗅鞘细胞移植物中都发现有神经纤维染色阳性的轴突存在，并且发现在Adv-BDNF组中由腺病毒所介导的BDNF的表达大大地促进了神经轴突的再生。有关功能恢复的观察也发现所有嗅鞘细胞移植组的大鼠在水平绳行走时与非移植组有明显的差异。Adv-BDNF组、Adv-NT－3组、Adv-BDNF与Adv-NT－3共同移植组的大鼠的后肢运动功能恢复良好，而后肢运动功能是与损伤面积的大小紧密相关的，所以，移植编码神经营养因子的嗅鞘细胞保护了损伤区周围濒临死亡的神经组织，促进了神经功能的恢复。该实验得出以下结论：①移植编码神经营养因子的嗅鞘细胞与非移植组相比较促进了后肢运动功能的恢复；②与非移植组相比所有嗅鞘细胞移植组损伤面积都比非移植组小，且移植编码神经营养因子的嗅鞘细胞是损伤面积进一步减小；③由于功能的损害与损伤面积紧密相连，故可推测嗅鞘细胞移植组减少了脊髓损伤以后引起的继发性损伤，从而保护了濒临死亡的神经组织，这在编码神经营养因子的嗅鞘细胞尤其明显；④在Adv-BDNF组中BDNF的表达使得再生的轴突长入宿主远端脊髓组织达1．0～1．5mm，但这与功能的恢复没有直接联系，组织学的研究表明嗅鞘细胞不能促进再生轴突长距离的生长，从而推测移植嗅鞘细胞后功能的恢复主要是通过保护损伤周围濒临死亡的神经组织来实现的。
如前所述，在啮齿类动物体内嗅鞘细胞移植能够使脱髓鞘的神经轴突重新形成髓鞘并且能促进神经轴突的再生，但是嗅鞘细胞移植在灵长类动物是否有同样的特性呢?Radtke C等研究将来自于表达墨角藻糖基乳糖酶(HT)的转基因猪的嗅鞘细胞移植进入非洲绿猩猩的脊髓中神经轴突脱髓鞘区，4周后观察其结果：在65%的脱髓鞘区域中出现了神经轴突髓鞘的重新生成，而在没有移植嗅鞘细胞的对照组则没有新髓鞘的生成。免疫组织化学方法证实所形成的髓鞘是来源于移植的嗅鞘细胞。另外，需要说明的是，同不表达HT基因的嗅鞘细胞移植组相比，移植HT基因转化的嗅鞘细胞不止2倍降低了补体的激活，从而降低了脊髓的继发性损伤。这一研究的重要意义在于证实了嗅鞘细胞在治疗灵长类脊髓病变中也起到了其在啮齿类动物中的作用，为临床上应用嗅鞘细胞移植治疗人类的脊髓损伤提供了坚实的基础。