神经生长抑制因子
出处：按学科分类—医药、卫生 中山大学出版社《脊髓损伤》第554页（6586字）
中枢神经系统再生障碍是脑和脊髓永久性损伤的主要原因，长期以来人们探讨各种途径试图突破这一障碍。神经生长因子以及随后发现的一系列神经营养因子对促进损伤神经元存活、生长，改善中枢神经损伤预后起到一定的作用；组织(细胞)移植和功能重建等外科手术治疗也可在一定程度上改善中枢神经系统损伤的预后。然而迄今为止人们尚不能从根本上恢复损伤的中枢神经系统神经功能。最近一种长期被认为抑制神经轴突再生的蛋白——勿动蛋白(Nogo)终于被鉴定和克隆。Nogo的发现引起神经科学界对轴突生长抑制性蛋白的高度注意，美国加州大学J．L．Goldbery和B．A．Barres博士对此给予很高的评价，认为Nogo基因的发现是“探索脊髓损伤和卒中病人治疗漫长道路中的一个里程碑”。与神经营养因子相比，轴突生长抑制性蛋白的研究时间并不长，自1988年首次证实抑制性蛋白NI－35／250的存在至今，其间不过十几年的时间，然而这类物质从与传统思路相反的角度探索CNS再生障碍机理，解释了许多以前无法回答的问题，取得的成果令人振奋。继续深入研究它的结构和功能有助于阐明中枢神经再生障碍机理，推动中枢神经损伤的临床治疗。大约100年前Ramon观察到中枢神经系统轴突损伤之初出现短距离再生(＜1mm)，但最终长距离再生失败。在中枢神经系统损伤部位移植外周神经后，神经元轴突能够生长至移植物内(长达30mm)，不过再生轴突一旦接触中枢神经系统，生长再次停止。因此中枢神经系统再生障碍并非神经元缺乏内源性再生能力，局部损伤环境可能是影响轴突生长的重要因素。已经证明，中枢神经系统白质中的髓磷脂和少突胶质细胞中存在神经再生抑制性物质，能够明显抑制成纤维细胞、神经肿瘤细胞以及原代培养神经元的粘附和轴突生长。1988年Schw ab等首次用SDSPAGE从大鼠的脊髓髓磷脂中分离获得两种轴突抑制性活性成分NI－35和NI－250；1994年McKerrache和Mukhopadhyay等发现大鼠髓磷脂中的MAG具有抑制轴突生长的活性；1998年Sp illman等从小牛髓磷脂中分离出具有抑制轴突生长的活性蛋白bNI－220。NI－35／250、MAG、bNI－220等均为髓磷脂相关性抑制蛋白，主要存在于白质。除此之外，其他具有轴突生长抑制作用的物质还包括崩溃蛋白(co lapsin)、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素蛋白多糖和tenascins等。MAG等抑制性蛋白在发育过程中主要参与调控轴突导向，引导轴突生长，协助构建精确的神经网络。具体说，在发育早期促进神经细胞迁移和轴突生长，修正轴突伸展方向，保证轴突朝靶组织定向生长，尤其是保证轴突沿轴索方向长距离生长；在发育后期抑制蛋白阻止神经轴突的过度生长，确保轴突停止在合适的边界。崩溃蛋白等抑制性蛋白随着神经系统发育成熟，在成年动物中表达降低甚至停止表达，但损伤等外来因素能够诱导它们表达增加或重新表达，此时具有阻止成年动物神经再生的活性。另一些抑制性蛋白如MAG等在成年动物保留，是髓鞘的重要组成成分。由于MAG直接与轴突接触，能够阻止神经元轴突发芽，避免神经纤维过度增生，维持成年中枢神经系统神经网络稳定性。这种抑制作用在神经损伤时也阻止了损伤神经元的轴突再生。由于对抑制蛋白的研究时间较短，因而对其结构、功能、组织分布、受体及信号转导等知之甚少。迄今为止研究比较清楚的主要包括Nogo、MAG以及崩溃蛋白等。以下概括介绍这3种抑制蛋白的结构和功能。
一、勿动蛋白(Nogo protein)及其受体NgR
(一)Nogo以及其受体NgR的结构与分布
由于启动子和剪切方式不同，nogo编码3种蛋白质：Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C。人的NogoA(hNogo-A)由1192个氨基酸残基组成，包含一个由1024个残基组成的胞间结构域，7个N－糖基化位点，多个O－糖基化位点，2或3个跨膜结构域和一个短的胞内区，相当于大鼠的NI－250。与Nogo-A相比，Nogo-B缺少了186～1004氨基酸残基，相当于大鼠的NI－35。而Nogo-C在相同位置缺少了相同数目的残基，但氨基端更短，故分子质量最小，相当于以往描述的大鼠的VP20和foocen-s。3种Nogo的氨基端没有同源性，也没有通常作为信号肽的疏水区。但它们具有相同的羧基端，由188个残基组成，包含两个疏水结构域，二者被一包含66个残基的亲水结构域(Nogo－66)分开，这一点与网状蛋白质家族成员极其相似，且Nogo主要存在于中枢神经系统少突胶质细胞内质网，故认为Nogo是网状蛋白质家族的第4个成员——网状蛋白4－A。在羧基端，Nogo有一个含双赖氨酸的内质网膜定位信号。Nogo的拓扑结构目前认为有3种可能：①Nogo的氨基端和羧基端位于胞液中，Nogo－66位于内质网腔或胞外；②Nogo－66位于胞液中，其余部分位于内质网腔或胞外；③Nogo－66与其氨基端位于胞液中，其余部分位于内质网腔或胞外。在成年哺乳动物，Nogo-A主要分布于中枢神经系统少突胶质细胞内质网，只有极少量位于少突胶质细胞表面，在某些神经元膜上或细胞内也有表达。施旺细胞和星形胶质细胞中未见分布。外周组织中，仅在睾丸和心脏中有少量分布。Nogo-B、Nogo-C的分布较Nogo-A广泛。除中枢神经系统外，Nogo-B在外周组织如软骨、肾脏、皮肤、肺及脾中也有低水平分布；Nogo-C在中枢神经系统主要分布于星形胶质细胞，在外周组织中大部分存在于骨骼肌细胞及脂肪细胞，心脏中也有少量分布。
通过筛选小鼠脑的cDNA文库，Nogo－66受体(NgR)被识别出来。此蛋白质包含473个残基，氨基端有一信号肽，其后为8个富含亮氨酸的重复区，羧基端含丰富的半胱氨酸，与糖基化磷酸肌醇(GPI)相连。作为一个糖基醇磷脂结合蛋白，NgR并不跨越细胞膜，其信号的转导必然要激活其他跨膜受体。实验表明，中枢神经系统髓磷脂中另外两种轴突生长抑制性蛋白——髓磷脂相关糖蛋白(MAG)与少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)，均通过NgR及与其相连的受体复合物发挥作用。Nogo－66与MAG结合于NgR的不同位点上，而Nogo－66与OMgp在NgR上的结合位点有重叠，故二者存在竞争。因此NgR似乎是中枢神经系统髓磷脂中各种轴突生长抑制性蛋白发挥作用的集中点。人类的NgR与小鼠NgR有89%的同源性，其基因的外显子位于22q11染色体上。NgR在中枢神经系统中分布广泛，灰质中含量较高，大脑皮层、海马、脑桥、小脑蒲肯野细胞也有分布，但不存在于少突胶质细胞。外周组织中，只有心脏和肾脏有极少量的分布。
(二)Nogo以及其受体NgR的作用及其机制
目前一致认为，Nogo-A是中枢神经系统髓磷脂神经元轴突生长抑制因子。依据如下：①NogoA主要存在于中枢神经系统髓磷脂和少突胶质细胞中；②Nogo-A抑制背根神经节神经元轴突生长及成纤维细胞延伸；③单克隆抗体IN－1可中和Nogo-A的轴突生长抑制作用，促进损伤后神经元轴突再生。Nogo-A长的氨基端及Nogo－66均有很强的轴突生长抑制作用。Nogo-A可能通过3种方式抑制神经元轴突再生：①细胞－细胞方式，即完整少突胶质细胞表面的Nogo－66与损伤神经元的NgR结合；②细胞－膜方式，即从受损少突胶质细胞脱落下来的含Nogo－66的膜片段与损伤神经元的NgR结合；③完全溶解的少突胶质细胞释放Nogo-A氨基端和Nogo－66的可溶性蛋白水解片段，与其受体结合，抑制作用更强。Nogo-A与其受体结合后，小鸟嘌呤核苷三磷酸酶(small GTPases)的Rho家族成员——rho、racl、cdc42及内源性第二信使在其信号转导过程中发挥了重要作用。用神经营养因子提高神经元内cAMP水平，激活PKA，使Rho磷酸化而失活，可以阻断髓磷脂对轴突生长的抑制作用。细胞内游离钙也与生长锥延伸和收缩过程密切相关。Nogo-A导致生长锥溃变之前，细胞内Ca2+浓度明显升高。Ca2+与钙调蛋白结合后，激活蛋白激酶，也可以导致Rho磷酸化而失活，促进生长锥延伸。因此可以认为，中枢神经系统神经元损伤后，溶解的少突胶质细胞释放Nogo-A氨基端和Nogo－66的可溶性蛋白水解片段，与其特异性受体复合物结合，通过第二信使作用于Rho，对生长锥中的微丝进行调节，使生长锥溃变，抑制轴突再生。除上述机制外，Nogo-A还对轴突生长相关基因有下调作用。轴突再生需要受损神经元上调某些与生长相关的基因，如c2jun、junD、gap243等。上述基因的表达上调或许由于神经元去除了某些来自轴突的抑制信号，Nogo-A可能是其中之一。因为使用IN－1后，细胞生长相关基因表达上调，轴突再生明显。此抑制作用的细胞内信号转导机制目前尚不清楚。Nogo-B与Nogo-C的功能目前研究较少。实验表明，Nogo-C在体外也能导致背根神经节神经元生长锥溃变。但由于二者分布较广，其作用靶点可能不仅限于中枢神经系统中。目前新发现一种基因ASY，其异位表达能有效诱导各种肿瘤细胞调亡。研究表明ASY编码的蛋白即为NogoB，诱导调亡的区域主要位于第二个跨膜的疏水结构域，具体作用机制尚不清楚。与Nogo相关的基因和药物治疗将成为CNS损伤后促进轴突再生新的有效手段。NgR的竞争性拮抗剂——NEP1240已被成功制备出来。体外实验表明，它能明显地促进受损中枢神经系统轴突生长及功能恢复。单克隆抗体IN－1已应用于大鼠脑缺血模型，取得了同样显着的效果。然而迄今为止，关于Nogo的许多问题仍有待精确阐明：Nogo分布广泛，特别是神经元中也有分布，还有其他哪些功能?Nogo确切的拓扑结构及作用机制是什么?其表达调控机制如何?对Nogo的深入研究将有助于推动中枢神经系统损伤的治疗。
二、髓磷脂相关性糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)
(一)MAG的结构
MAG相对分子质量(Mr)为100000(相当于100kD)，约含有600个氨基酸，包括一个较长的胞外区、一个跨膜区和2个胞内区。胞外结构域含有5个Ig样结构域。氨基酸序列中Arg118影响MAG与神经元轴突结合，当Arg突变成Ala或Asp，结合作用消失。MAG有Mr为72000(L-MAG)和67000(S-MAG)两种形式，发育早期中枢神经系统中MAG主要为Mr72000，成年为Mr67000，外周神经系统在不同发育时期均为Mr67000。
(二)MAG的功能
MAG是髓鞘的重要组成成分，成年动物缺乏MAG时导致广泛的脱髓鞘。1994年McKerracher和Mukhopadhyay及其同事分别证实MAG体外具有抑制神经突起的活性。脊髓背根神经节细胞接种在涂有MAG的培养板上，突起生长受到强烈抑制；雪旺氏细胞转染MAG后明显抑制脑细胞和脊髓背根神经节细胞的突起生长，突起分叉明显减少。髓磷脂经免疫沉淀处理去除MAG组分后抑制作用减弱。脑细胞和脊髓背根神经节细胞突起在MAG－／－小鼠的外周神经和中枢神经损伤后轴突再生数目和长度明显超过MAG+／+小鼠。MAG是导致中枢神经系统和周围神经系统神经再生能力差异的重要原因之一。MAG约占中枢髓磷脂蛋白的1%，占外周髓磷脂蛋白的0．1%。外周神经系统髓磷脂中MAG含量只有中枢神经系统的1／10。因此周围神经系统髓磷脂对神经再生抑制作用较弱。另外，周围神经系统损伤后，吞噬细胞迅速聚集在损伤部位，髓磷脂碎片清除较快，利于轴突再生；相反，中枢神经系统损伤部位吞噬细胞较少，抑制性物质不易清除，轴突再生受到抑制。
(三)MAG的信号转导机制
MAG氨基酸序列胞外区含有Ig样结构域，与免疫球蛋白基因超家族成员CD22和sialoadhesin相似，后两者主要与唾液酸结合。当神经元经脱唾液酸处理后MAG抑制作用被部分逆转，MAG的轴突生长抑制作用与唾液酸存在量效关系。据此推测神经元膜表面唾液酸结构可能是MAG作用的受体部位。完整的抑制性蛋白信号转导通路目前尚不清楚，但其中一些较为重要的信号转导环节已在探索。Song等认为轴突对抑制性蛋白的反应取决于神经元胞内环嘌呤核苷的水平。MAG与神经元膜受体结合引起细胞内cAMP水平下降。人为升高胞内cAMP能够阻断MAG的抑制作用。BDN F刺激细胞内cAMP升高，同样可以阻断MAG的轴突生长抑制效应。除环嘌呤核苷外，小鸟嘌呤三磷酸核苷酸酶如rac1、cdc42、rho A等，可能参与抑制性蛋白的信号转导。PC细胞以及原代培养视神经元用Rho抑制剂C3酶处理后，神经元轴突能够在MAG或髓磷脂等抑制性底物上生长。了解轴突生长抑制性蛋白的受体及信号转导对治疗中枢神经系统损伤很有启发：例如根据MAG的神经元受体的唾液酸结构，可以设计特异配体与之结合，从而阻断MAG的神经再生抑制效应；了解cAMP等参与神经元轴突生长抑制性信号转导，可以人为升高神经元cAMP以促进中枢神经系统的再生。
三、崩溃蛋白(collapsin)
(一)崩溃蛋白的结构
崩溃蛋白是semaphorins家族成员之一，即semaphorins，属于分泌性糖蛋白，由Luo等首先从鸡胚胎运动神经元培养上清以及成年鸡脑中分离获得。崩溃蛋白含有772个氨基酸，Mr100000，等电点7165。N端含有高度保守的Sema结构域，C端含有一个免疫球蛋白样结构域和强碱性结构域。Sema结构域约含500个氨基酸，是崩溃蛋白的活性部位，免疫球蛋白样结构域和强碱性结构域增强抑制活性。崩溃蛋白通过cys723形成活性二聚体，单独Sema结构域没有活性。崩溃蛋白虽然不存在跨膜区，但由于结构中强碱性结构域的存在，能够与细胞膜磷酸基团结合，因此为水不溶性蛋白，需要去污剂才能分离。
(二)崩溃蛋白的功能
崩溃蛋白在神经发育期抑制／排斥轴突生长锥，影响生长锥伸展方向，确保其向靶组织定向生长。实验发现成年大鼠嗅球以及脊髓损伤后瘢痕组织中崩溃蛋白及其受体的mRNA水平升高，崩溃蛋白的表达增加一方面直接抑制、排斥轴突生长，构成胶质瘢痕分子性屏障；另一方面崩溃蛋白与星形胶质细胞表面的受体结合，调节星形胶质细胞的迁移、增殖和分化，促进胶质瘢痕形成，构成胶质瘢痕物理性屏障。与中枢神经系统不同，外周神经组织损伤时崩溃蛋白的表达下降，允许新生轴突向远端神经残体延伸，为周围神经系统再生提供条件。
(三)崩溃蛋白的信号转导机制
大鼠胚胎感觉神经元存在与崩溃蛋白高亲和力的跨膜蛋白neuropilin。缺失neuropilin影响到崩溃蛋白的轴突导向作用，提示neuropilin可能是崩溃蛋白的受体或受体复合物组分之一。与MAG类似，崩溃蛋白的生长锥抑制作用可被细胞内cGMP逆转。细胞缺失rac1或cdc42后，崩溃蛋白引起的生长锥萎陷现象消失。