分子生物学检测技术

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《果树育苗手册》第73页（1101字）

分子生物学检测法是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在。此方法比血清学方法的灵敏度要高(能检测到10^－12克水平的病毒)，特异性强，有着更快的检测速度，操作也比较简便，可用于大量样品的检测，另外，该法适应范围广，其应用对象既可以是DNA病毒和RNA病毒，也可以是类病毒。

1．核酸分子杂交技术 互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程称为杂交。杂交的双方是所使用的探针和要检测的核酸。检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交，即细胞原位杂交。目前，用来检测植物病毒的核酸分子杂交法中被广泛应用的方法是点杂交。所用探针必须标记，以便示踪和检测。最初的核酸杂交试验是用放射性同位素(如³²P)标记探针，但这对常规检测工作是不利的，而且探针寿命短。近几年来应用非放射性探针分子，如生物素或地高辛标记的探针分子更安全，应用限制更少，寿命更长，与放射性标记的探针一样灵敏和实用。

2．多聚酶链式反应(PCR)技术 PCR技术是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法，是美国科学家Mullis等人1985年发明的。近10多年来，该技术已经被广泛地应用于生物学诸多领域的研究中，也包括果树病毒病检测的研究，并且已经取得了很好的效果。但是，我国在这一领域的研究还刚刚起步。北京市农林科学院林业果树研究所利用该技术成功地建立了果树病毒的PCR分子检测体系，已经可以实现对苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒、葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒以及李属坏死环斑病毒等的准确检测。

3．双链RNA(dsRNA)电泳技术 病毒粒子是由病毒核酸(DNA或RNA)和结构蛋白亚单位的整齐复合物所构成。绝大多数果树病毒和类病毒核酸是核糖核酸(RNA)。病毒复制过程是以单链RNA(ssRNA)为模板，合成双链RNA(dsRNA)的。dsRNA也叫复制型RNA，简称RF。dsRNA对RNA氧化酶具有抗性，抗性的大小是ssRNA的2倍。因此，只要果树感染病毒和类病毒，植株体内就会有dsRNA存在。未受病毒或类病毒侵染的果树，植物体内就没有这种高分子量dsRNA的同源片断。因此，可以通过凝胶电泳分析，检测dsRNA的数目和大小，确定待测病毒的类群。dsRNA检测法具有快速、灵敏、简便等优点，既可有效地检测病毒，又不受寄主和组织的影响。