军团菌属
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第321页（8690字）
军团菌是新发现的一种细菌，系退伍军人热即军团病(Legionnaires disease)的病原体。1976年7月美国退伍军人协会宾州分会在费城一旅馆举行年会时，爆发了原因不明的肺炎大流行，其后就称其为军团病。次年McDade等人从病料分离出一种革兰氏阴性杆菌，被证实为军团病的病原体。1979年Brenner正式提出建立军团菌属。现在军团菌属中有22个种和34个血清型，较常见的有嗜肺军团菌(L．pneumophila)、长滩军团菌(L．longbeachae)和搏杰曼军团菌(L．bozemanii)等，本文叙述以嗜肺军团菌为例。
军团病在美洲、大洋洲、欧洲和亚洲许多国家流行。除人发生之外，已经从马、牛、羊、猪、犬、鸡、鸭、鹅等畜禽和野生动物中分离到该菌或检测出特异性抗体。我国已在某些地区发生本病的流行，并从人体和羔羊中分离出病原体。
军团病的主要表现为呼吸道症状。体温升高，可达39～41℃，呈弛张热，全身不适。呼吸困难，胸痛，咳嗽，有粘痰，有的痰中带血，胸部听诊有干、湿啰音。有的出现肝功能变化和肾功能衰竭，尿中有蛋白及红细胞，还有出现神经症状的，自然病死率为15～30%。
一、病原菌特性与实验室诊断
(一)涂片检查 嗜肺军团菌为革兰氏阴性，但不易着色，据报道，用丙酮代替95%酒精脱色，染色效果好。其大小为0．3～0．4×2～3μm，有的呈杆状，两端钝圆；有的微弯曲呈纺锤状，也有呈丝状的。培养菌因生长条件等的不同呈多形性，在稳定期的末期，丝状体变成链状的雪茄样杆菌，继而断裂成对，再培养或限制培养时则变成球状。
除用革兰氏染色外，常用Gimuiez及镀银染色法，下面主要介绍前两种染色法。
1．革兰氏染色法：涂片后首先用甲基紫染10s，然后用碘液染15s，丙酮脱色1～2min，再用1%沙黄液复染，菌体呈红色。
2．Gimuiez染色法：
(1)染色原液：临用前将100ml碱性复红酒精溶液(10g碱性复红溶于100ml95%乙醇)，250ml4%石碳酸溶液(10ml石碳酸加入250ml蒸馏水)及650ml蒸馏水混合，置37℃48h。
(2)染色液：
稀释碱性复红液：4ml上述原液加10mlpH7．450．1mol／1磷酸盐缓冲液，(含3．5ml0．2mol／lNaH2PO4；1．55ml0．2mol／lNa2HPO4及19ml蒸馏水)，立即过滤，配好后约48h内染色效果良好，如时间太久，则有大量沉淀，需重新用原液配制。
0．8%孔雀绿水溶液。
(3)染色方法：标本火焰固定，加稀释复红染色液，染3～ 5min，水洗。加孔雀绿染液染色约1min，如涂片不呈绿色，可再用孔雀绿液染数秒钟，水洗，待干。
(4)结果：菌体为红色，背景为绿色。
涂片染色镜检不是本菌的特异检验方法，不能依此来肯定或排除本病，最后确诊有待于细菌的分离和鉴定，免疫荧光抗体检查或血清学试验等。
(二)细菌分离
1．样品采取 采集呼吸道分泌物、肺穿刺液、肺组织等。
2．分离培养 嗜肺军团菌最适生长温度为35℃，最适pH为6．9，需氧，但要求2．5～5%的CO2，通常用烛缸法培养，厌氧条件下不生长。
军团菌初次分离的方法是：取组织样品研磨后，用生理盐水或PBS稀释，给豚鼠接种，豚鼠发病死亡后，采肝、脾制成悬液，接种于6日龄的鸡胚卵黄囊，35℃孵育4～5日，再将卵黄囊液制成缓冲液悬液，接种于CYE或BCYE或LCVB琼脂培养基上进行分离培养。
分离培养程序如下表。
3．分离培养用培养基
(1)活性炭酵母(浸膏)琼脂，培养基(CYE培养基)：目前应用较为广泛，除作为分离培养基外，还可制成斜面保存菌种。其成分为酵母浸膏10g、活性炭2g、L-半胱氨酸0．4g、可溶性焦磷酸铁盐0．25g，琼脂17g，加蒸馏水980ml。配制时除半胱氨酸及焦磷酸铁盐以外，将其他成分溶解混合，经121℃15min灭菌，置水浴中冷却到50℃左右，加新制备的经过滤除菌的半胱氨酸溶液10ml(内含0．4g半胱氨酸)及焦磷酸铁溶液10ml(内含焦磷酸铁盐0．25g)。调整pH为6．9。在50℃时加入1mol／L氢氧化钾4～5ml，冷却后再用表面电极或联合电极，测定pH至6．9。
(2)缓冲液活性炭酵母(浸膏)琼脂，培养基(BCYE培养基)：即在CYE培养基灭菌前加入缓冲剂N-2-乙酰氨基-乙氨基乙醇磺酸10g，无需二氧化碳，在有氧环境即能生长。
(3)增菌培养基：在CYE培养基中加入硒酸钠盐5～10mg／ml，18h可见菌落生长。
(4)半选择培养基：在CYE培养基中加入万古霉素(1mg／ml)及多粘菌素(≤40u／ml)，可用于痰及呼吸道分泌物样品直接分离培养。
(5)LCVB琼脂：(肺消化汤巧克力复合维生素B琼脂，系南京军区总医院及南京市卫生防疫站配方)：猪肺消化汤：新鲜猪肺250g，绞碎，加蒸馏水至1000ml，浓盐酸2ml(使pH为2～3)，胃蛋白酶2g，在56℃水浴中消化15h，时时摇动。取出后置沸水浴中10min终止消化，脱脂棉过滤，补足失水，加蛋白胨10g，Tris1g，用10mol／LKOH调正pH至6．9～7．0。再置沸水浴10～15min，冷后用滤纸过滤，即为猪肺消化汤。
取猪肺消化汤1000ml，加入活性碳2g，琼脂17g，121℃20min灭菌，于80～85℃水浴中保温，加入脱纤羊血100ml，使呈巧克力色。待冷至60℃左右，加入注射用复合维生素B(无菌蒸馏水配成1%)10ml，L-半胱氨酸(无菌蒸馏水配成4%，6号玻璃滤器过滤)10ml，混匀后倾注平板或斜面。
(6)硝酸铁盐培养基(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所配方)：
成分：蛋白胨 10g
酵母浸膏 10g
甘氨酸 3g
硝酸铁(FeNO3·9H2O) 0．25g
L-半胱氨酸 0．4g
活性炭 2g
琼脂 20g
制法：将前四种成分加蒸馏水至1000ml，微加温助溶后，用0．1mol／LKOH调整pH为7．0左右(因高压后，pH值稍有降低，最终pH值在6．95左右)。
将后两种成分加入上述培养基中，浸泡混匀数分钟后，121℃20min灭菌。
将0．4gL-半胱氨酸溶于6～10ml左右蒸馏水，用0．3～0．45μm滤膜过滤除菌，加入50℃左右的上述培养基中，摇匀后倾注平皿，37℃孵育18～24h，进行无菌检验后，4℃保存备用。
4．人工培养基上生长特点 在CYE培养基上培养4～5日后，可见有限几个灰白色凸起菌落，直径1～2mm，10日后菌落数不增加，但在原有菌落表面出现不平的乳头状突起物，外沿呈闪光及浅黄灰色，在BCYE琼脂培养基为黄绿色菌落。直接接种标本在CYE琼脂时，只有在CO2环境中方能生长。在LCVB等培养基上也形成灰白色的圆形小菌落。
本菌不发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、果糖、阿拉伯胶糖等任何碳水化合物，接触酶阳性，氧化酶阳性、β-内酰胺酶阳性，尿素酶阴性，硝酸盐还原试验阴性，液化明胶，马尿酸盐水解试验有的为阳性。
(三)直接免疫荧光抗体检查法(DFA) 直接荧光抗体检查法可用于新鲜肺组织的压印片或福尔马林固定的刮取物以及下呼吸道的液体，如痰液、气管抽出液、支气管洗液和胸水，亦可用于培养物的涂片染色。这一方法应当与组织切片染色、尸体解剖和活体组织的细菌培养法结合起来。
直接免疫荧光抗体检查方法如下。
涂片—→空气中自然干燥—→加热固定—→置潮湿的小盒中，用10%福尔马林固定10min—→用蒸馏水冲洗—→空气中干燥—→加上结合物(荧光素标记的抗嗜肺军团菌的多价或单价抗体)，置潮湿小盒中20min—→用蒸馏水冲洗—→空气中干燥—→滴加pH9．0的缓冲甘油→荧光显微镜检查。
二、军团菌免疫血清和荧光抗体的制备
(一)军团菌免疫血清的制备 用含1%福尔马林生理盐水洗下固体培养基上35℃烛缸培养48～72h的军团菌，过夜杀死，再悬浮在0．5%福尔马林生理盐水中，将其浊度调整到4×109菌细胞／m1。次日，将菌液离心，再悬浮于0．25%福尔马林PBS(pH7．2)中，浊度为4×109菌细胞／ml。每隔5天，给家兔耳静脉注射1次。
第1次0．4ml，第2次0．5ml，第3次1．0ml，第4次2．0ml，第5次2．0ml，第6次2．0ml，第7次2．0ml，第8次2．0ml。
一周后全放血。效价一般可达1∶10000～20000。
(二)军团菌荧光抗体的制备
1．抗血清粗提
(1)饱和硫酸铵的配制 硫酸铵(AR)160g加至1000ml蒸馏水中，加温溶解，此时，液面可形成薄膜，用28%氨水调pH至8～9，如有褐色含铁成分沉淀，趁热用滤纸过滤，可得透明液体．室温冷却，用1∶2H2SO4调整pH至7．0～7．2备用(多余的硫酸铵析出沉积于底部)。
(2)pH7．2PBS的配制
NaCl 8．5g
Na2HPO4(无水) 1．07g
NaH2PO4·2H2 O 0．3g
溶于1000ml蒸馏水中，113℃15min灭菌备用。
(3)用50%硫酸铵提取 一定体积的军团菌抗血清及正常家兔血清分别加入等体积(V／V)的生理盐水，然后分别按体积(V／V)加入等量的饱和硫酸铵溶液。加入硫酸铵溶液时要一滴一滴加入，并随时搅拌。置室温(15～18℃)15min，再置4℃冰箱40min(或过夜)弃去上清(上清中含α及β球蛋白)。沉淀物再按上述步骤重复提取1次。这时沉淀物中含有盐分，将沉淀物用生理盐水溶解后，置透析袋中，流水透析半小时，再置4℃冰箱用pH7．2PBS透析过液，需换液3～4次，以除去盐分，用萘氏试剂进行检查，直至无
为止。
2．抗血清精提 通过Sephadex G-200柱或用溴化氰活化的SPA-Sepharose提取抗血清IgG部分(主要是IgG)。
3．荧光色素标记抗体 用异硫氰酸盐荧光素(FITC)标记抗体，步骤如下。
(1)用紫外分光光度计(280nm)测蛋白总量，用冷却的pH7．2PBS将抗体蛋白稀释成10～20mg／ml。
(2)按蛋白量的1／80～1／100加入FITC。称好所需的FITC后，装入小瓶中，加一定量的pH9．50．5mol／L碳酸盐缓冲液，使之充分溶解。溶解后要在5min内滴到抗体球蛋白溶液中，时间过长，FITC发光性会减弱。
(3)按1∶9比例将上述配成的FITC液(2ml)滴加于抗体球蛋白稀释液中(18ml)。具体方法是用灭菌吸管吸取FITC液，缓缓加入到抗体球蛋白稀释液中，其间不断搅拌抗体球蛋白液，但应防止起泡，加完后测定pH，要求在8～9。
(4)置4℃冰箱内搅拌6h。
(5)透析用pH7．2PBS透析4h。
(6)SepnadexG-25凝胶过滤。具体方法是取Sepnadex G25干粉30g加入1000ml蒸馏水中，浸泡(如20ml血清样品，柱体积容量20×7～8=140～160ml)。浸泡膨胀后，用pH7．20．01mol／L PBS平衡后装柱(切勿太快，以免柱中有气泡；太慢则易产生断层现象)，然后加样、层析16～20滴／min和收集荧光抗体样品。荧光抗体液大约较样品稀薄两倍左右，而蛋白质回收率则约达100%。当快速移动率组分收集完毕时，即应停止收集，由于碳酸盐不能用肉眼看到，所以在快速移动率组分收集完毕后，必须用pH试纸不断测试→并用军团菌株进行测试，合格后即可用于DFA染色。
其他血清学检查法有微量凝集、间接凝集、间接免疫荧光抗体染色法(IFA)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)等，下面仅对前两种方法作一介绍。
1．微量凝集反应(以检查马的血清为例)
(1)材料准备
①抗原：将军团菌接种于LCVB琼脂斜面上，于35℃条件下烛缸培养4天，用含1%福尔马林pH6．4PBS洗下菌苔，4℃冰箱过夜。3000r／min离心30min，弃上清液，将沉淀物悬浮于pH6．4PBS中，并用分光光度计(420nm)测定OD值，用PBS将OD值调整为1．0(每ml含15～20亿个细菌)，即为军团菌抗原，4℃冰箱保存备用。
②被检血清：静脉采血，凝固后分离血清，于-20℃保存备用。
③阳性对照血清：效价不低于1∶1024。
④PBS：以0．01mol／LpH6．4PBS稀释抗原，0．01mol／LpH7．2PBS稀释被检血清。
(2)方法 被检血清56℃水浴30min灭活，在V型微量反应板上作试验。在第1孔加入灭活的被检血清0．025ml，用pH7．2PBS作倍比稀释(1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256等)，然后分别于每孔加入抗原0．025ml，用微型振荡器振荡3～5min使之混匀，用另一块玻璃板或微量反应板将其盖好后，置37℃温箱4h，再于室温处放4h，在灯光下眼观判定结果，马血清以出现“++”的最高稀释度为微量凝集试验滴度。每次试验设两个对照，即PBS加抗原(应不出现凝集)为阴性对照，已知滴度的阳性血清加抗原为阳性对照。
滴度判定：90～100%凝集者为++++，70～80%为+++，50～69%为++，25～49%为+，24%以下为一。
据有关资料报道，人的血清凝集试验滴度≥1∶16判为阳性；马牛血清凝集试验滴度≥1∶64为阳性。
2．间接血凝试验(PHA) 将军团菌抗原致敏火鸡或绵羊红细胞，以微量血凝技术检查特异性抗体，其效果准确、快速、简易。
(1)材料
①可溶性抗原的制备：将军团菌接种到LCVB琼脂上，于35℃烛缸培养72h，每块平皿生长物加入3ml的无菌pH72PBS，洗下菌液收集于灭菌三角烧杯中，用铝锅蒸煮1h(100℃)，3000r／min30min，弃去上清，0．5ml菌液悬浮于10mlpH7．2PBS中(这种制品称为第一次洗液)，然后置4℃冰箱10天，使可溶性抗原释放。
②双醛化绵羊红细胞：按常规方法，用甲醛及丙酮醛固定绵羊红细胞。
③军团菌的血清型抗原可以用标准株免疫动物制备。
④待检动物血清。
⑤缓冲液。
甲、0．11mol／LpH7．2PBS：Na2HPO4·12H2O28．38g，KH2PO44．19g，NaCl19．0g，加蒸馏水1000ml。
乙、生理盐水。
丙、0．2mol／L pH3．6醋酸—醋酸钠缓冲液：0．2mol／L醋酸钠0．75ml(CH3COONa MW82．040．2mol／L16．408g+1000ml水)，0．2mol／L醋酸(12ml冰醋酸+988ml水)9．25ml。
丁、含0．04%牛血清白蛋白的0．01mol／L PBpH7．2(也可用2%正常兔血清磷酸盐缓冲液，稀释血清或配制致敏血细胞)。
(2)方法
①致敏血细胞悬液：取10%双醛血细孢0．1ml，离心弃上清，加0．5ml0．2mol／L pH3．6醋酸钠缓冲液，再加最适浓度抗原(预先用方阵滴定)0．5ml，混匀，放56℃水浴致敏15min(每5min摇动一次)，离心弃上清，用pH7．2PB洗3次，最后加含牛血清白蛋白的pH7．20．01mol／L PB1．6ml，使之成为0．7%致敏血细胞悬液，
②于V型微量反应板上按常规方法操作，反应液总量0．075ml，以被检血清出现50%凝集(++)的最高稀释度为终点，分别以兔抗军团菌的抗血清为阳性对照，用稀释液代替被检血清为阴性对照。每分血清需做两排，第一排每排滴入致敏血细胞0．025ml，第二排每孔加入0．025ml未致敏血细胞(对照)置37℃1～1．5h判定结果。人的终点≥1∶16判为阳性，马、牛的终点≥1∶64判为阳性。
概括起来，检验程序如下。
被检标本
