猪细小病毒

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第597页（1971字）

本病毒只侵犯猪，与猪的妊娠障碍，如不孕，死胎和胎儿木乃伊化等有关。

一、样品采集

可采取流产、死产胎儿的肾、肺、肝、肠、脑、睾丸和淋巴结以及胎盘等。

二、病毒分离

一般应用细胞培养。原代乳猪肾细胞和传代猪细胞均可作病毒分离。后者中以SK和IBRS-2细胞系最适，而PK-15不一定能得到满意的结果。

1．由于病毒对处于有丝分裂状态的细胞易于感染，所以，必须在细胞尚未长成单层时就行接种。接种病料乳剂的量为营养液量的1～3／10，37℃吸附90～120min。

2．如用原代细胞，还须有未接种细胞培养进行盲传作对照，以防潜伏性感染。

3．细胞感染后24～72h可产生CPE，细胞呈弥漫性颗粒样变化，变圆脱落，以至溶解。如无可见CPE，必须盲传2～3代。

4．不同细胞培养所得到的感染滴度可不同，一般在10⁵-10^6．5TCID₅₀／0．2ml，血凝滴度可达1∶1024。

5．在感染后16～36小时，可见核内色涵体。

6．直接用感染猪组织作细胞培养，常能获得更理想的结果。感染猪的血清抗体滴度愈高，分离到病毒的可能性愈大。

三、血清学试验

(一)HA和HI试验 猪细小病毒可凝集豚鼠、人O型、恒河猴、小白鼠、大白鼠、猫和鸡的红细胞，但以豚鼠红细胞所得结果最为理想。试验可在试管内或微量滴定板上进行，所用缓冲液的pH为7．2～7．3，红细胞浓度在试管法为0．5%，微量法为1%，4℃孵育4～6h。室温下结果不甚可靠。

HI试验用试管法或微量法均可。

1．制备0．5%或1%的豚鼠或鸡的红细胞悬液。缓冲液可用pH7．2的PBS或巴比妥缓冲液，后者不能含钙、镁离子，用时作5倍稀释。

2．血凝抗原可用病毒的细胞培养物制得。将呈现典型CPE的细胞培养物收获，冻融3次，用前测HA价，按试验要求的抗原单位进行稀释。

3．血清先经56℃灭活30min，再按1∶10比例加入50%的豚鼠红细胞悬液，混匀后，4℃放置1h，离心去红细胞。以除去血清中非特异性凝集素。

4．用缓冲液将血清作连续对倍稀释，每个稀释度加入等量的血凝抗原(含8个单位)，混匀后室温下感作1h。

5．加入等量0．5或1%的豚鼠红细胞悬液，混匀后置4℃下4～6h后判定结果。

6．判定标准：HI滴度在1∶8以上者，判为阳性。感染猪的滴度可达1∶1024～1∶4000。

(二)中和试验 可用SK或IBRS-2细胞系。

1．将滴度约10³TCID₅₀／0．1ml的病毒悬液与等量不同稀释度的灭活血清混合，室温下放置2h。

2．取0．2ml分别接种到3～4支培养24h的细胞培养管，37℃吸附1h，补足维持液。

3．旋转或静止培养5-10天，判定结果。可用HA试验或荧光抗体染色法测定病毒的感染性。

(三)琼扩试验 沉淀抗原可用木乃伊胎猪的脏器悬液。

1．用硼酸盐缓冲液(0．9%硼酸，0．2%NaOH和0．01%叠氮钠，pH8．6)配制1%琼脂糖，融化后倒板，打孔。孔距2．5mm，孔径6mm。

2．每孔加样50μl，抗原加于中央孔，已知血清与待检血清相间加于周围孔。

3．将板置于湿盒内，室温下48h，即可判定结果。

(四)间接荧光抗体技术 此法可检查接种后8～36h的细胞培养，以鉴定病毒的存在。也可快速检测感染胎儿中的病毒抗原或抗体。