环状病毒属

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第697页（4298字）

本属病毒均为虫媒病毒，病毒子也有双层衣壳，外层没有明确结构而具弥散性，内层呈环状而有32颗壳粒。病毒基因组分10个节段。与呼肠孤病毒属区别之处，除形态外它对pH3稳定，对乙醚较为敏感。本属分12个血清学亚群，其中有些在兽医上有重要性。

一、蓝舌病毒(Blue tongue virus)

本病毒有21个血清型，能感染绵羊、山羊、牛和其他野生反刍动物，能通过胎盘感染，在精液中也能检出。绵羊表现明显临床症状，山羊和牛通常为隐性感染。病毒存在于血液中，主要附在红细胞和白细胞上，血浆中极少。本病传播媒介为库蠓，其他吸血昆虫仅为机械传播。直接接触不传递。

(一)样品采集 在发病早期(特别在体温升高前)采集病羊血液，以后病毒滴度逐渐下降。病死动物可采脾、次为肝等含血多的器官。

(二)病毒分离 病羊抗凝血离心后弃去血浆，用PBS(pH7．2)洗2次。

1．细胞培养

(1)适宜的细胞为Vero-M和BHK-21细胞系，也可用MVPK(一种猪肾细胞系)。

(2)将红细胞裂解液(见鸡胚接种1)或鸡胚悬液(见鸡胚接种3)接种细胞单层，吸附1～2h。通过鸡胚的病毒更易在细胞培养中生长。

(3)倒去样品液，用Hanks液洗一次，加入维持液，不加或加2%血清。

(4)在37℃培养10天，每天观察CPE(细胞增大变圆，颗粒增多，逐渐自玻面脱落)，每周换2次维持液。如用转管培养更好。

(5)如无细胞病变，可将细胞从玻面括下，经冻融后传代一次，一般都能检出。

2．鸡胚接种 鸡胚静脉接种的敏感性很高，可与接种绵羊相媲美。

(1)用乳糖蛋白胨缓冲液(含青、链霉素各1000IU／ml)将红细胞作1∶5稀释，经超声波处理以破坏红细胞。

(2)10～12日龄鸡胚6枚，静脉内接种红细胞裂解液各0．1ml。

(3)33～34℃(不是37℃!)培养7天，48h以前死亡者弃去，收采3～7天死亡并有水肿和出血病变的鸡胚。将胚磨碎后作连续10倍稀释，再次接种鸡胚静脉以滴定毒价，或者接种细胞培养。

(4)鸡胚不死可认为没有本病毒存在。

(三)血清学试验 由于本病毒有21个血清型，应先检测群特异抗体，次检型特异抗体。

1．中和试验 此法敏感性很高，应用最广，主要用于型特异抗体的检测。中和抗体至少存在一年。试验一般在细胞培养中进行，也可应用鸡胚静脉接种。还有一种在微量滴定板(平底孔)上进行的快速空斑中和试验，公认敏感性和特异性都强。此法步骤简述如下。

(1)被检血清、已知病毒(30PFU)和Vero-M细胞15万依次加入孔中，或者血清与病毒作用1h后加入细胞。

(2)在37℃放置4～5h，细胞贴附并形成单层。此时将液体吸去。

(3)加入琼脂覆盖层，在37℃培养，观察空斑形成情况。

(4)计算空斑形成被抑制的程度(与阳性和阴性血清对照比较)。

2．凝胶溶血试验 此法快速简易，敏感性高。

(1)制备2．5%琼脂糖凝胶，加热融化并冷至45℃时加入0．1%叠氮钠、10%豚鼠补体、2．4%绵羊致敏红细胞(用部分提纯的蓝舌病毒吸附于其表面)，混合后浇成平板。

(2)打孔，孔径3mm，孔距12mm。

(3)每孔加入灭能被检血清10μl。

(4)置湿盒中，20℃以上放置24～48h。

(5)观察孔周溶血情况。如内层全溶血，外围呈半透明弥漫状，溶血圈在5mm以上者为阳性。

3．微量琼扩试验 主要用于群特异抗体的检测。可溶性抗原一般由有关单位提供，制备方法是用转管培养的细胞培养液，加入羟胺灭活，浓缩到原量的10%以下即可。凝胶用0．9%琼脂糖，pH8．5。

4．补体结合试验 此法主要检测群特异抗体，仅能用于近期感染，超过4个月即不能测出。

5．间接荧光抗体技术 也是群特异抗体的检测方法。

二、茨城病毒(Ibaraki virus)

茨城为日本地名，Ibaraki为音译。茨城病又名类蓝舌病，因其临床特征与蓝舌病接近。此病也感染牛羊，但与蓝舌病相反，它在牛中产生临床症状和引起死亡，而在绵羊中为隐性感染。病毒的形态与蓝舌病毒相同，但抗原性没有交叉。除日本外此病流行于东南亚和我国台湾。虫媒也是库蠓。

(一)样品采集 采集发病早期的血液；病死动物可采集脾，次为多血的器官。

(二)病毒分离

1．细胞培养 可用牛胚肾原代细胞，但更多应用BHK-21细胞系。病毒容易适应，不必先通过鸡胚接种，细胞病变通常在3～7天内出现。细胞培养的敏感性不及犊牛接种，但后者不易做到。

2．鸡胚接种 与蓝舌病毒一样可用静脉内接种从抗凝血提取的红细胞悬液。

(三)血清学试验 应用于蓝舌病毒的试验均可应用于本病毒。在中和试验中本病毒与鹿流行性出血病毒Alberta株之间有明显的交叉关系。根据空斑减数试验，可以认为本病毒是鹿病毒的一个血清型。

三、鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus of deer)

本病毒引起的疾病是一种非接触传染的虫媒病，由库蠓传播，能感染某些鹿种，而另一些鹿种不易感。临床症状和病损与鹿的蓝舌病相似。本病毒有2个血清型，形态与蓝舌病毒无法区分，但抗原性没有交叉。

本病在1岁以下的小鹿中引起大量死亡，而成年鹿一般无死亡。在牛中呈隐性感染，绵羊不易感。

(一)样品采集 与蓝舌病同。

(二)病毒分离

1．细胞培养 可选用BHK-21或Vero-M细胞，病变主要为细胞变圆并聚集成丛。

2．鸡胚接种 不能适应。

3．实验动物 乳鼠脑内接种引起全部死亡，传4代后回归鹿只能引起亚临床感染。

(三)血清学试验

1．中和试验 用BHK-21或Vero-M细胞培养生产抗原，在细胞培养中与被检血清作中和试验。

2．空斑中和试验 可用培养瓶作常规空斑试验，也可在微量滴定板上作微量空斑试验。

四、非洲马瘟病毒(African horse sickness virus)

非洲马瘟主要感染马，骡的易感性较低，驴更低，其他动物一般不易感。病情轻重差别极大，重者死亡率高达90～95%，轻者约25%。本病不接触传染，传播媒介可能是夜间活动的吸血昆虫，有人怀疑是库蠓或伊蚊。

本病毒有9个血清型，它们之间至少存在2种以上的共同抗原成分。

(一)样品采集 在发病早期采集脱纤血液、脾、肾或淋巴结。将样品贮于4℃或-50℃以下，在-20°～-30℃很易灭活；在50%甘油缓冲液中也很稳定。

(二)病毒分离

1．细胞培养 本病毒能适应Vero或BHK-21细胞系和BHK原代细胞，但敏感性不如乳鼠接种。如果先通过乳鼠则更易适应。不是每种血清型都出现细胞病变。在感染细胞靠近核的胞浆中出现很多巨大的包涵体。

2．动物试验 3～5天龄乳鼠对本病毒的易感性很高，脑内接种0．03ml样品，潜伏期为4～20天，在第一代死亡率即可达100%。传代后死亡时间可缩短到2～7天。适应毒株能在成鼠和鸡胚中生长。

(三)血清学试验

1．补体结合试验、琼扩试验、荧光抗体技术均可用于群特异抗原的检测，但不能定型。在鉴定本病时可采集双份血清，观察抗体升高情况。

2．中和试验可检测型特异抗原，因此可以定型。

3．血凝和血凝抑制试验感染本病毒的乳鼠脑浸出液能凝集马的红细胞，适宜条件为pH6．4，37℃，2h。此法也可用以定型。