马铃薯块茎的电泳鉴定法

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《农作物品种鉴定手册》第278页（2291字）

1．一般说明 根据德国生化所H．Stegemann博士对全欧马铃薯块茎进行蛋白质和酯酶电泳鉴定品种的研究(H．Stegemann，1975，1976，Index of Europea Potato Varieties)。他认为，马铃薯品种可按其成熟块茎蛋白质和酯酶电泳图谱的差异，加以有效的鉴别。

2．蛋白质和酯酶电泳鉴定法

(1)样品的选用 电泳材料可选用新鲜块茎或贮藏块茎。新鲜块茎应选在叶片枯萎后的成熟块茎。贮藏块茎应贮藏在4－10℃下。如块茎已长出较长的幼芽，可能会造成电泳图谱产生一些差异，但这种情况时，须用同样生育阶段的块茎作为比较。

(2)块茎的准备 先除去幼芽，用冷水冲洗，刷净，再用吸水纸吸干，然后进行编号，称重，分别放在－20℃进行深度冷冻16小时。

(3)蛋白质和酯酶样品提取 预先将冷冻块茎放在室温下解冻2．5小时，或放在4℃下过夜。用水力压榨器榨出汁液。

也可用新鲜块茎提取。预先剥去皮层，切出一半，用2层(20×20cm PVC)纸包好，用压榨器缓慢地加到200个大气压，在加压前在压榨器的容器里加入0．5ml新配亚硫酸钠溶液(1gNa₂SO₃和0．75g Na₂S₂O₅溶于20ml无离子水中)，最后将浓度调节到2%亚硫酸钠(v／v)，混匀和冷却，并除去纸的残片。

(4)离心 样品移入80ml离心管，并平衡，吸去多余的提取液，做好标记。然后放在15000×g离心30分钟。电泳时，吸取0．8ml样品作电泳样品，其余剩余部分放在深度冷冻下保存备用。

(5)电泳 用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用1M Tris／硼酸缓冲液(pH8．9)，或者用0．25M Tris／硼酸缓冲液(pH7．9)进行电泳。每个样品槽加样品提取液20－50μl。

(6)蛋白质染色 利用考马斯亮蓝R250染色。即将蛋白质电泳胶板放入0．025%染色液反应3小时，或用0．01%染色液反应过夜。

染色液配法是，在800ml无离子水中加入6%三氯醋酸，再加入200ml甲醇和70ml醋酸。然后从上述溶液取400ml，再加入10ml1%染色液配成。

脱色液配法是，将水、甲醇和醋酸按14∶6∶1比例配成。将染色胶板脱色3－4次。

(7)酯酶染色 酯酶染色可用α－醋酸萘酯和磷酸缓冲液(pH7．2)进行染色。在α－醋酸萘酯加固蓝RR盐。

磷酸缓冲液配法是称取107．4gNa₂HPO₄·12H₂O溶于2000ml无离子水中(A)和称取41．4g NaH₂PO₄·1H₂O溶于2000ml无离水中(B)，然后取A液120ml和B液80ml，即配成pH7．20．15M磷酸缓冲液。

染色时，先将胶板先浸入200ml pH7．2磷酸缓冲液中浸5－10分钟(室温下)。

然后再移到由40mg α－醋酸萘酯溶解于3－5ml丙酮中，再加些水，使之成混浊液，并马上与带胶板的磷酸缓冲液混合，最后加入100mg固蓝RR盐，(先用少量溶解)进行染色。在室温下染色1小时，至蛋白质谱带清晰，而底色较淡色为度。到时间后，用自来水冲洗，停止反应，并用水、甲醇、醋酸(75∶20∶5)(V／V／V)组成脱色液，进行脱色。

(8)谱带记录 将胶板放在湿的清洁玻璃板上，排去气泡，并用脱脂棉吸去多余的色素，然后用碳纸(或玻璃纸)衬在胶板两面。再将胶板移在毛玻璃板上(65×35cm)，并用4支日光灯管照亮，用Laitz-Reprovit照相机进行照相，焦距30cm。然后Rodinal50ml加400ml水进行显影12分钟。

曝光条件：

(1)蛋白质胶板曝光1分钟，光圈16，橙色滤光镜(×4)；

(2)酯酶胶板曝光1－2分钟，光圈16，不须滤光镜。

【参考文献】：

〔1〕浙江农业大学编着(1961)，作物栽培学，(P413)，上海科学技术出版社。

〔2〕浙江农业科学院作物育种栽培研究所(1964)，农作物田间试验记载项目及试行标准，《浙江农业科学》编辑室。

〔3〕浙江农业大学种子教研组编(1982)，种子检验简明教程，农业出版社。

〔4〕H．Stegemann(1976)，Index of Euro pean Potato Varietes，Kommissionsverlag Paul Parey。