胚胎发生的生物化学
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第54页（8102字）
本节着重讨论由一个体细胞或花粉细胞发育成一个独立的胚状体结构的生物化学变化，这一研究是有重要意义的，但对它了解甚少。
(一)体细胞胚胎发生的生物化学
1．大分子组份的变化 为决定组织的生长周期中大分子成份的变化，通常的目标是定量地测定大分子合成的速率和由合成降解所决定的数量上的增加或减少。最引人注意的大分子是核酸和蛋白质，虽然，不同的研究人员都对胡萝卜细胞悬浮培养的生长和胚胎发生中的DNA、RNA和蛋白质代谢进行了研究，但正如下面表明的，由于所用的起始材料的特征不同，以及培养的不同步，在获得的数据之间存在着一些明显差异。
Verma和Dougall(1978)发现在加生长素的培养基上，生长的直径在6．3-12．5um之间的胡萝卜细胞丛中DNA的含量在9天以内都以指数增长，在此以后，速度减慢，明显地是由于培养基中营养成份缺乏。在没有生长素时，胚胎发生细胞中有相似的DNA积累模式，只是这些细胞在10天后DNA还是继续增长。另一方面，利用同步细胞培养，Fujmura等(1980)发现，与加有生长素的培养基上生长后的胡萝卜的非胚胎发生细胞相比，在没有生长素的培养基上生长的胚胎发生细胞，在培养后3-4天时，表现出的DNA含量，并且与第一次球形胚的出现相吻合。以3H-胸苷标记表明，3天以后在缺乏2，4-D的培养基上生长的细胞中，染色质和核物质迅速复制，是胚胎发生诱导中预期的一个转折点。
从Verma和Dougall(1978)的工作看来，在转移到新的培养基上6天以内，胚胎发生的和非胚胎发生的胡萝卜细胞的RNA和蛋白质以相似的速率增加；此后，非胚胎发生的细胞比胚胎发生的细胞积累更多的RNA和蛋白质。相反，其它研究人员注意到甚至在转移到新的培养基后的早期就看到在胚胎发生细胞中有较高RNA和蛋白质。虽然这种差异的原因尚不清楚，这一结果促进了关于胡萝卜细胞培养中胚胎发生培养诱导中的RNA和蛋白质代谢作用的进一步分析。
为了准备胚胎的形成，在培养时，胚胎发生细胞中的RNA和蛋白质比非胚胎发生细胞中RNA来得明显地高。Fujimura等(1980)进行同位素标记，他用3H-尿苷和3H-亮氨酸。分别作为RNA和蛋白质合成的前体，他们证明，在培养后约两天，胡萝卜的胚胎发生细胞比非胚胎发生细胞整合各个前体进入大分子的速率要高。而胚胎发生中RNA和蛋白质的增加是如此之小，所以不能用合成的增加来解释，故有人提出在胚胎发生细胞中有活跃的RNA和蛋白质的转化。这一观点得到Sengupta和Raghavan(1980a)的实验的支持，他们发现在短时间标记实验中，在转接到新鲜培养基之后，早达2-4小时内，胚胎发生细胞的RNA和蛋白质合成速率就比非胚胎发生的细胞中有可见的增加。胚胎发生细胞中RNA合成能力的增加一直持续到转接于无生长素培养基上12小时以后，既然在转接后12小时内悬浮培养中没有任何新细胞出现，那么RNA合成后增加十有八九是由于细胞中RNA的合成。在转接后96小时，可见到RNA合成的另一小峰值。这与第一个胚胎的出现相一致。虽然总的说来这些结果表明RNA和蛋白质合成的增加是与胡萝卜细胞悬浮培养中的胚状体诱导相联系的。但对数据的解释由于已知的2，4-D对植物RNA及蛋白质合成的非专一性促进而变得复杂化。这样，不加生长素的胡萝卜细胞悬浮培养基对胚胎发生中特殊RNA和蛋白质的合成的增长是有一定作用的。而且可能部分抑制了某些非分化生长必需的RNA和蛋白质的合成。
Sengupta和Raghavan(1986)对单标记或双标记的RNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和低聚(dr)纤维素亲和层析，以决定在体细胞向胚胎发生细胞转化的早期RNA合成的特性．在双重标记的实验中，胚胎发生的胡萝卜细胞生长在缺2，4-D的培养基上，以3H-腺苷标记，而同样年龄的非胚胎发生细胞放在含有生长素的培养基上培养以14C-腺苷标记，在同位素中孵育后，两细胞混在一起后提取RNA。在包括2．5%的丙烯酰胺，0．125%的双丙烯酰胺和0．5%琼脂糖的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离RNA。电泳以后，把胶切成1mm的圆盘，以闪烁计数法来确定每一圆盘中3H和14C的放射性。根据对应于紫外吸收曲线的凝胶盘数目来计算3H和14C的比例。
为分离富多聚腺苷RNA，把标记的总和RNA与酵母载体RNA一起溶解在结合缓冲液中(0．01M Tris-HCl，pH7．5，0．4M NaCl：0．5%NaDodSO4)。然后与事前以结合缓冲液．平衡过的低聚(dr)-纤维素混合，离心后，除去上清液。以结合缓冲液洗涤低聚(dr)-纤维素，直到不再有放射性的RNA洗脱出来，这与上清液一样都是缺少多聚(A)的RNA、富含多聚(A)的RNA以0．01M Tris-HCl(pH7．5)和0．05%NaDodSO4来洗脱，在酒精中沉淀。
为分离多聚(A)片段，把从低聚(dr)-纤维素柱中释放的结合RNA放在胰RNA酶中孵育，然后加入RNA酶T1，不被酶作用的RNA用三氯乙酸沉淀，沉淀中由于多聚(A)引起的放射性用闪烁计数法检测。
这些实验中得到的数据表明，培养基中缺生长素对细胞的RNA合成类型有以下影响。在转移到缺乏生长素的培养基上以后，在6h内，RNA合成速率下降，并伴有12s—18s范围的RNA小片段合成的增加。另一方面，在96h的实验周期内胚胎发生细胞比非胚胎发生细胞以更高的速率合成含多聚(A)的RNA(po1yA+RNA)。通常认为向mRNA加上多聚(A)残基是mRNA作为多聚的先决条件。所以这些结果表明，培养基中缺乏生长素是通过诱导合成含有多聚(A)的mRNA来控制胚胎发生中的生化反应的。
然而，证据还不能说明在胚胎发生的诱导中mRNA的合成有开关作用。早些时候我们已经看到，将细胞转移到不带生长素的培养基上会有蛋白质合成的增加，问题是这些蛋白是否由新合成的mRNA模板翻译来的。换句话说，在什么范围内，当细胞培养在富含生长素的培养基上时合成的mRNA与转接到无激素的培养基上合成的相反，是指导着胚胎发生过程的呢?用3′-脱氧腺苷，一种多聚腺苷酸形成的抑制剂进行研究得出试验性的结论，在无生长素的培养基上生长的胡萝卜细胞的胚胎发生诱导是在转录-转译水平上都受控制的。例如，已经注意到，当细胞转接到不含生长素而含10．0mg／1，3′-脱氧腺苷的培养基上时，会抑制腺苷酸多聚化的90%，体细胞胚的形成停止在球形期或心形期，既然腺苷酸多聚化过程的抑制剂不抑制胚胎发生细胞中的蛋白合成，那么看来在无生长素的培养基上细胞早期几个小时的蛋白合成，不是由新转录和多聚(A)mRNA(Po1y(A)+mRNA)翻译而来的。先前在细胞接触生长素时形成的mRNA还能在转移到无生长素培养基上以后的早期阶段继续进行蛋白合成。在富含生长素的培养基上分化的细胞，这表明在细胞转接到缺乏生长素的培养基上去以前，mRNA的合成在某些程度上是受阻的。假如这一段假设正确，而且合理的话，那对我们关于胚胎发生的生物化学的知识的一个主要贡献应当是对mRNA受阻机制的分析。
在胡萝卜体细胞胚胎发生中的生化反应的复杂性，使得看起来可能2，4-D是部分控制了胚胎发生的变化，而不是完全促进非分化生长。从胡萝卜细胞悬浮培养中胚胎发生的超微结构研究中，Halpaerin和Jensen(1967)争辩道，胚胎发生的诱导可能是在组织分离和在包含生长素的培养基上生长的过程中发生的，虽然只要有生长素存在，重现了合子胚的高度组织化的结构的形成就受到抑制。最近，Sung和Okimto(1981)以双向电泳研究了胡萝卜的胚胎发生和非胚胎发生细胞的新合成蛋白质的大致情况。在他们的工作中，用3H-甲硫氨酸标记蛋白质，在12天的胚胎发生细胞中发现了两个蛋白称作胚胎蛋白。令人惊异的是不管在培养基中有无2，4-D，在新鲜培养基上生长的早期都有这些蛋白的合成，但在有2，4-D的情况下，这些蛋白逐渐减少，而12天后彻底消失。既然在有2，4-D的条件下生长的细胞悬浮体具有球形的胚胎发生细胞团，看来胚胎蛋白的合成是受生长素控制的胚胎发生的早期反应，但培养基中的生长素也阻止了这些对胚胎发生的成熟过程必需的蛋白的进一步合成。胡萝卜悬浮细胞发育的多面性是由于胚胎蛋白的作用引起的。它是分化的早期标记。丙烯酰胺凝胶中带的深浅反映出在芹菜叶柄外植体的胚胎发生中有蛋白成份的显着变化。
2．基因组的作用 从前面看来，基因组对胡萝卜体细胞向胚胎母细胞的过渡有较大影响。既然胚胎发生的基因显然是在抑制细胞非分化生长特殊培养条件下转录的，那我们能否假设胚胎发生是与染色体蛋白质的数量和质量的变化相关的呢?回答这一问题一条道路就是分离染色质(由DNA、组蛋白、酸性蛋白，可能还有一些RNA形成的一种混合物)并研究组蛋白或非组蛋白对胚胎发生的作用。在两类核蛋白中，组蛋白很早就被认为是调节基因活动的，特别是对停止表达的基因。但是其他研究都倾向于看低在基因表达中的作用，因为它们看起来缺乏专一性。结果，主要注意力就指向非组蛋白对基因表达的调节作用。虽然胚胎发生的和非胚胎发生的胡萝卜细胞之间，组蛋白没有数量上的变化，但总的组蛋白中H1的比例与胚胎发生的细胞中要比非胚胎发生细胞中低。有人提出这是与胚胎发生细胞的染色体的结构变化有关，这种变化促进了基因表达。另一方面，在胚胎发生细胞的非组蛋白电泳中发现有特有的几个小的酶带的变化。而且，从14天的胚胎发生细胞制备的非组朊蛋白比相似地从非胚胎发生细胞制备的在恢复为组蛋白抑制，DNA控制的RNA合成上更有效。很有意思的是，正是在细胞中测到有两种胚胎蛋白质时，非组蛋白促进染色体转录的能力增加。从以上这些实验看，组蛋白和非组蛋白平衡的变化程度，或者通过控制DNA模板的活力来阻止胡萝卜细胞的胚胎发生，都还是未定的。在组蛋白和非组蛋白的比例与胚胎发生过程之间精确关系还未了解以前，我们还必须对胚胎发生和非胚胎发生细胞的整个核的DNA与染色体蛋白质之间的关系进行更多的研究。
3．其他生物化学的变化 除了核酸和蛋白合成以外，在胚胎发生中无疑还涉及了代谢的许多其他领域。对悬浮培养尤是这样，既然胚状体母细胞与合子不同，只是相对于预期发育过程的分化的简单的薄壁细胞，不幸的是，对体细胞胚胎发生中的生化反应极少研究，而且即使这些资料有用，而这些反应对决定以后的细胞分化的作用也是不确定。Montague等(1978)发现在胡萝卜的胚胎发生和非胚胎发生细胞之间，多胺代谢有显着不同。比如，在转接到无2，4-D的培养基处理24小时内，胚胎发生细胞中的丁二胺浓度几乎达到2倍。与此一致的，精氨酸脱羧酶活性在胚胎发生细胞中比非胚胎发生细胞中高。而且在细胞转移到胚胎发生培养基上6小时内，这种酶活力差异是显着的。虽然这一结果表明精氨酸脱酸酶对胡萝卜体细胞胚胎发生有一定作用，特别是对丁二胺的水平的调节，但这是否代表对最终基因表达的影响还有待进一步研究。
在胚胎发生培养基和非胚胎发生培养基上的胡萝卜细胞的一些同工酶的电泳谱带是不同的。谷氨酸脱氢酶氧化和L-谷氨酸NADP氧化还原酶的分布差异最大，在胚胎发生细胞中只有迁移慢的酶带而在非胚胎发生细胞中为迁移快的酶带。根据Kochba等(1977)的实验，Shamouti柑桔愈伤组织的胚胎发生系中，伴随着胚胎的出现，过氧化物酶活性很高。特别有意义的发现是在活力升高的过程中，在胚胎发生细胞系的酶的同工酶谱带中有新的带出现。暂时看来，胚胎发生中的酶谱的变化还是不清楚的。少量有用的证据表明，谷氨酸脱氢酶同工酶的变化是与胚胎发生细胞中的氮代谢相关的。
另一方面，胡萝卜胚胎发生细胞中的类脂中脂肪酸的变化可能是量的而不是质的。尤其在生长于缺少2，4-D的培养基上的小的分生组织群向体细胞胚后期转变过程中，可见这种变化。在这一系统中，细胞悬浮体中溶解的氧的降低导致了细胞ATP水平的上升，发现诱导胚胎发生。Corylus avellana L．和日本泡桐的愈伤组织培养中的胚胎发生的组织化学分析，表明在体细胞胚分化中，细胞的淀粉含量有明显增高，在胚胎发生中，细胞的淀粉量也保持高水平。
(二)花粉胚胎发生中的生物化学
从花粉粒形成胚胎的过程与体细胞胚胎发生是不同的。但是无论在体细胞胚胎发生中还是在花粉胚胎发生中，没有进行过不可逆分化的细胞，可以在已经决定的范围内，在相同程度上，跟合子一样的途径表达它们受阻的基因潜能。因为这一原因，前面一节中已涉及许多关于花粉胚胎发生的生化知识。
与花粉粒形成胚胎相关的生物化学变化主要是通过细胞化学和放射自显影研究推论来的。烟草胚胎是通过营养细胞的反复分裂形成的。在胚胎发生花粉粒中明显缺少RNA和蛋白质的积累，而在培养条件下成熟的并且完成了配子发育过程的花粉粒积累的这些大分子的量相对要高。根据这些结果，认为胚胎诱导的开头反应是配子体发生过程的抑制，这就可以肯定在胚胎发生的分裂涉及的蛋白质编码基因可以不受同时发生的花粉管萌发和花粉管生长所需的基因表达的抑制而完全表达。与此相似，南洋金花的胚胎发生花粉中，在花粉培养后很快有一个RNA积累降低的时期，虽然在营养和生殖细胞的形成以后跟着有细胞质的亲吡罗红素的增加。在同一段时间内花粉的组蛋白成份先增加，然后又降低。根据Sang wan(1978)的实验，在光曼陀罗的胚胎发生过程中有一个很快的氨基酸代谢的变化，但既然分析是以培养的花药进行的，那就还不能肯定氨基酸滴定率的变化是发生在花药的体细胞组织还是在花粉粒中。天仙子胚的比例是来源于双核细胞花粉的生殖细胞的分裂。Raghavan(1979)指出，一经进行花药培养并伴有放射自显影可检测的RNA合成，花粉粒的胚胎发生性就决定了。第一次单倍体有丝分裂以后，在花粉粒中就开始了胚胎发生的分裂，那里生殖核或者生殖核和营养核一起合成RNA，而那些RNA合成只发生在充满淀粉粒和非胚胎发生的营养细胞核中。因此，天仙子中的花粉胚胎发生看来与单核花粉粒以及以后形成的生殖细胞中RNA合成的最初水平有关。
进一步的工作是要决定是否胚胎发生的花粉粒合成的RNA包含某些带有胚胎发生分裂信息的rRNA。在这一工作中，在培养的不同时期以3H-多聚尿苷酸作组织学处理，进行原位杂交，以观察多聚RNA在胚胎发生过程中的分布，这些实验的结果表明在花药培养后的几个小时内，有一小部分单核的胚胎发生，决定了的细胞中有可见的同位素的结合，而大多数花粉粒，是非胚胎发生的，不结合任何3H-多聚尿苷。在含有放线菌素D的培养基上，单核的胚胎发生细胞中没有3H-多聚尿苷的结合，可以得出结论，含多聚腺苷mRNA是花粉粒与培养基接触后所新合成。既然在培养的时候以及个体发育的早期这些单核花粉粒中不结合3H一多聚尿苷，那么这种mRNA可能与胚胎发生有关。对配子体发育及花粉胚胎发生诱导中的生殖细胞和营养细胞的3H-多聚尿苷结合能力进行比较分析，可以了解一些它们如何对不同发育信号作出反应的情况。这些资料表明，在正常的花粉发育途径中，营养细胞和生殖细胞只有短暂的结合3H-多聚尿苷的能力。从核邻近的细胞质中的3H-多聚尿苷结合能力可知，具有潜在胚胎发生能力的双核花粉粒的显着特性是生殖核的不断转录的能力。总的说来，这些研究可以得出结论，由于花药分离的损伤和培养作用，一部分包含的花粉粒可以通过内含多聚腺苷的RNA的合成来改变它们的发育途径。这种RNA可能是为诱导单倍体分裂所必需的酶而编码的。花粉粒的进一步分裂是由另外的也可能是新合成的生殖核来的mRNA来调节。另一方面，营养核合成的mRNA使得配子体发育途径永存，而导致淀粉的积累。
从以上所述，显而易见导致体细胞和花粉粒走上胚胎发生途径的生化变化是平行的。生化变化的具体过程可能有所不同，这是由实验材料或者所用的胚胎发生诱导条件决定的。
总之，对体细胞胚胎发生的生化研究目前还只限于所谓模式系统胡萝卜中，相似的研究应当扩展到那些体细胞胚胎发生的作物中去。即使对诱导体细胞胚有困难的植物，分化的分子基础的知识可以帮助设计更好的方案来诱导高频率的体细胞胚胎发生。
研究花粉胚胎发生过程的生物化学的最难对付的困难是在培养的花药中，只有很低频率的花粉粒是成为胚胎发生的。因此，以整个花药为基础进行分析得到的关于胚胎分化的资料，必须考虑到占压倒多数的非胚胎发生花粉粒的背景。作者的观点是只有解决了常规地大量地诱导花粉粒的胚胎发生这一问题，花粉胚胎发生中的未知的生物化学变化和分子变化才能被揭示出来。
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