培养方法
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第164页（4147字）
选择三种果实和种子结构类型很不同的冬青水稻和大豆需要不同剥胚程序的属培养未成熟胚的详细培养方法如下。
(一)冬青
1．种子准备 深秋或冬季收集成熟果实(核果)。放入冰箱(0-4℃)备用。塑料袋装0℃下可保持生活力约一年。从干果或种子取胚，会进入难解除的休眠，将对胚培养不发生反应。种子用10%Clorox表面消毒5-10min，无菌兜囊中用无菌双蒸馏水洗3次。
2．取胚 冬青胚位于珠孔端，分三步用单面刀片切开内果皮(硬质)：第一步在种子中部横切，弃去非珠孔部分。第二、三步从脊和内果皮边纵切露出胚乳，取出胚乳。在其中线以下3／4处纵切，刀尖向胚乳顶尖。余下的1／4未切胚乳裂开，在其表面露出发育不全胚。冬青胚极小，心形或心后期长仅0．28-0．73mm，视种而定。易因受压或解剖用具而损伤。用解剖针把胚接种在培养基表面上。培养并封口。
3．制备培养基 曾用LS和White培养基取得成功。用后者培养构骨叶冬青发育不全胚，生长率较慢，但反常发育百分较低。培养基附加4%蔗糖，0．7%琼脂。不需加外源生长调节剂或天然植物提取物。在高压蒸气消毒前，用1．0或0．1M NaOH调节pH6．0。高压蒸气消毒过程(15磅15min)将使pH降到约5．5。然后分装。
4．培养 冬青胚发育最适温度未经测定。25℃常温产生好结果。胚完成发育和准备发芽前暗培。钝齿冬青和轮生冬青暗培10天；I．galata，I．opaca和落霜红二周；构骨和猫儿刺三周，构骨叶冬青4-7周。
培养体移入光暗，不需转移。可用扩散自然日光或16h光周期4000lx荧光，都能满足幼苗生长。
移栽 待有2-4真叶时，可移栽温室，遮荫保湿2周。移置荫处，除去遮蓬，待幼苗逐渐锻炼后，移入直接日光下。
(二)水稻
Ko等(1983)提出培养程序，特别适用于乳熟后期到糊熟期未成熟水稻胚，授粉后约10-18天，胚长0．5mm。
1．种子准备和取胚
①需要发育时期取带小穗的穗。除去病瘪粒。
②自来水洗10min。
③浸入70%乙醇1-2min。
④用脱脂棉吸干。
⑤将穗移入3．5%次氯酸钠加吐温20少量3-4h。
⑥用无菌水充分洗表面消毒过的穗。
⑦分别取小穗，放在火焰消毒过的铝箔上。
⑧用无菌剪刀在小枝梗端以上2-3mm处剪下小穗。
⑨用中指与食指慢慢挤出胚，注意不接触切口端。
2．培养基 SR加有CH和高浓度蔗糖，用于生长中未成熟胚。加NAA与KIN虽对幼胚有益但不必要。A培养基用于诱导愈伤组织和增殖。加2，4-D和KIN是重要的。
3．培养 曾用16h光周期，光强6000lx，26±1℃。为了防止过早发芽，开始时暗培几天，当取幼胚培养的话。培养后2-3天培养的胚开始生长和发芽。
(三)大豆
本程序用于培养0．2-2mm大豆未成熟胚。
1．种子准备荚宽是选择胚发育时期最好指标。大豆cu、Williams79需要0．2-0．4mm胚(心形期与子叶期开始)，选荚宽3．0-3．7mm，开花后约4-5天，含种子长2．0-2．35mm。如需1．0-2．0mm胚(子叶早期)，选宽7．0-9．0mm荚，开花后约8天，种子长3．0-3．3mm。
采取二步消毒法，以适应表面毛茸藏有气泡的种荚。首次浸入75%乙醇，搅动1min以下。然后浸入10%Clorox溶液加吐温20，超声波10min。用无菌蒸馏水洗去残留Clorox，换水2-3次。把表面消毒种荚夹在湿无菌纸片中，备用。
2．培养基 培养长1mm以下胚，可用LS大与微量元素，B5有机成分，Yeung(1979)的氨基酸混合物(500mg／L谷酰胺，100mg／L丝氨酸，100mg／L门冬酰胺，和250mg／LCH)，和0．1μM NAA，1．0μM BA，10μM ADE和8%蔗糖。当培养较大胚时，应将蔗糖降低到2-4%。液培与固基培无差异。固化培养基用琼脂0．7%。培养在装每穴21／2ml高压蒸气消毒培养液的24穴预先消毒的塑料板内，穴大17．8×16mm。
3．剥胚 大豆球形和心形期胚裹在薄层细胞胚乳中，加压可从切口挤出。子叶期胚长4．5mm已能挤出而无损伤。培养长0．1-1．0mm未成熟胚程序如下：
①用乙醇消毒的手指将种荚分成二半。1-3种子可能联结在每个半爿上。
②将半爿荚片放在解剖显微镜台上，带种子面向上。
③用食指尖向下轻压尖端。种子珠孔端用无菌微型解剖针或最细缝纫针切二个割口。注意把切割深度控制在种壳厚度内。
④除去种壳，露出胚。胚为胚乳细胞所包着，埋藏在非细胞汁中。
⑤用针从胚乳细胞取出胚，接种在培养基上。注意不要折断胚柄(解剖心形或较幼期胚时)。每穴一胚，将24穴板放在塑料袋中，作为无菌湿室。
4．培养 常温25℃16h光周期4000lx常用于培养培养体。一个月内胚从0．2-0．4mm长大到8．25±1．04，和从1．0-2．0mm长大到11．85±1．90mm。以后生长率下降。把胚转入蔗糖浓度降低的新鲜培养基中，或可促进生长。
【参考文献】：
〔1〕Bhojwani，S．S．and M．K．Razdan 1983 Zygotic embryo culture．In： Plant Tissue Culture，Theory and Practice．pp．199-235，Elesevier，Amsterdam，Monnier，M．1978 Culture of zygotic embryos．In：Frontiers of plant Tissure Culture．(T．A．Thorpe ed．)pp．277-286，Univ．of Calgary Press，Calgary．
〔2〕Nostog，K．1979 Embryo Culture as a tool in the study of comparative and development morphology．In：Plant Cell and Tissue Culture．(W．R．Sharp，P．O．Larsen，E．F．Paddock and V．Roghavan eds．)pp．179-202，Ohio State Univ．Press，Columbus．
〔3〕Raghavan，V．1976 Experimental Embryogenesis in Vascular Plants．Academic Press，New York．
〔4〕Raghavan V．，1977 Applied aspects of embryo culture．In：Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell，Tissue and Organ Culture(J．Reincrt and Y．P．S．Bajaj eds．)pp．375-397，Springer Verlag，Berlin．
〔5〕Raghavan，V．1980 Embryo culture In： Perspectives in Plant Cell and Tissu e Culture．International Review of Cytology Suppl．11B(I．K．Vasil ed．)pp．209-240 Academic Press，New York．
〔6〕Wardlaw，C．W．1965 Physiology of embryonic development in conmophytes．Encyclopedia of Plant Physiology，vol．15／1(W．Ruhland ed．)pp．844-965，Springer Verlag，Berlin．