程序
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第190页（10723字）
(一)提取液的制备和蛋白质测定
提取蛋白质有很多不同的介质，使用时须实验多种后才决定选用一种介质；但必须记住关键在于保持酶不失活。作比较研究时，前后使用同种提取系统是很重要的。我们现在仅描述一种简单而有效的程序。
1．提取
①选择合适的植物材料，如细胞悬浮培养物愈伤组织、植物组织。
②细胞(悬浮培养)或愈伤组织收集于Miracloth上，其量相当于一个微孔过滤器(15ml)的使用量。
③用甘露醇溶液反复冲洗材料。
④细胞或愈伤组织可以用几种方法提取。(i)在一个冷的微型French压力室(3．7ml)。提取液(表9-2)与植物材料的比例是1ml／lg(压力为140MPa)。(ii)在Polytron匀浆器(带有PT 10ST的探针发电机)。最小量可磨1ml。加1滴n-octanol防止起泡沫。(iii)用任意大小的玻璃组织匀浆器。
表9-2 抽提和蛋白质检测的试剂
⑤提取在5℃下进行。
⑥匀浆组织在30000×g离心1h。提取液贮存在N2气4℃中。
2．蛋白质测定 蛋白质分析建立在沉淀步骤和Lowry的改良方法上。沉淀步骤非常重要，以除去干扰下面染色步骤的蛋白质。
3．蛋白质沉淀
①将样品(10-50μl，依蛋白含量多少而定)置于15ml圆锥形离心管中。
②顺次加入3ml蒸馏水和25μl次氯酸溶液。
③摇匀并静置15min。
④加入1ml TCA溶液(表90)。
⑤搅匀后离心1300×g30min。选用水平头的离心机为好。
⑥倒掉上清液。
4．显色(染色)
①加1ml反应液A至有沉淀的离心管中。可采用涡旋混合器进行混合。
②沉淀物溶解后，加入3ml反应液B，加热50℃ 15min。
③冷却，转移至合适的比色杯中，在分光光度计中测625nm值。
④读数比较由结晶牛血清蛋白制得的标准曲线。
(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳时最常用的是Davis描述的(1964)碱性缓冲液系统。如需采用酸性缓冲系统，仪器可采用圆柱形的或更好的板状制胶模具。我们采用Bio-Rad Model220板状电泳室。可选用各种凝胶电泳设备。
1．胶的制备
①选择两个干净玻璃板，140mm×120mm×1．5mm。将板状胶投放在两板之间。下面反应液的用量即为这种大小的板。
②将下列溶液混合制成5%分离胶：3．0ml溶液1(所用溶液见表9-3)，4．0ml溶液6和5．0ml蒸馏水。
表9-3 凝胶电泳所需溶液pH8．9
③用水抽气泵抽气1min然后加入．12ml溶液7。
④立即铺板至需要的高度，大约l00mm。迅速将成胶板推至凝胶上，从而避免气泡存留于玻璃板与凝胶之间。在胶上细心地灌入水以覆盖胶面。不要触动胶面。静置至少1h，再加浓缩胶。
⑤浓缩胶由0．75ml溶液2，1．5ml溶液3，3．0ml溶液5和0．75ml溶液4混合制备。按上法抽气1min。
⑥倒掉分离胶上层的水，用滤纸条除去剩余水分。将浓缩胶加至分离胶顶部，然后插入梳子形成样孔。轻轻在胶上灌水覆盖。
⑦将胶板置于荧光光源前面(8em之内)，聚合浓缩胶1h。
2．样品的电泳
①在电泳之前，将梳子小心取出不要破坏样品槽。将水倒掉，用电极缓冲液(见下面)洗样品槽，最好使用注射针管。
②溶液8按1∶10稀释成电极缓冲液加入电泳室的阳极和阴极槽内。
③加入大约1μl溴酚蓝(0．5%水溶液(w／v))至100μl蛋白提取液中。
④置蛋白提取液(通常100μl蛋白)于样品槽的底部，最好用Hamilton注射器加样。
⑤电泳部件联到一循环冷却水浴(4℃)上。
⑥接通电源，通以约1h的0．5mA电流。功率增至10W(恒定功率)，继续电泳直到溴酚蓝移至胶板底部1cm处(通常约90min)。
⑦切断电源。从玻璃板上取下凝胶。从分离胶上用刮刀除去浓缩胶，在右上角刻缺口以标记凝胶。
⑧凝胶干后溴酚蓝的位置通常能看到。但是，如果颜色易退掉，可通过其位置小心处理凝胶加以辨别。
⑨胶转移至盛适当的染色液的盘内。当需要用手接融凝胶时戴上手套。
3．凝胶染色
①实验室常用的同工酶染料及其组成列于表9-4。
表9-4 检测凝胶上同工酶的常用染色剂
a．最近提出更敏感的酶检测法，采用基质L-胱氨酸亚磺酸，而不是天门冬氨酸。
②凝胶置于染色液中，其中含有底物，辅助因子，和染料，直至带显出，时间范围可从10-90min或更长。氨肽酶是一个例外，因为凝胶要先在37℃于底物(溶液A)中保温30min，然后再于溶液B中染色。
③当染色已完全时，弃去溶液，凝胶浸泡并保存于7%醋酸(v／v)中。氨肽酶和天冬氨酸氨基转移酶保存于水中。
④蛋白质检测则用3．5%(w／v)过氯酸溶液，其中含有0．04%(w／v)考马斯亮蓝G-250染凝胶。然后脱色过夜，在下列溶液中进行，至少更换两次：100ml乙基醋酸，70ml乙醇，50ml乙酸及780ml蒸馏水。
4．凝胶保存和记录
①染色后，以闪光玻璃荧光箱对凝胶拍照。永久的记录则保存在35mm黑白底片上，显色保存备用。
②通过计算谱带移动的距离与溴酚蓝迁移距离的比值算出相对迁移值。
③凝胶在市售的凝胶板干燥器上干燥后保存。我们采用一个Bio Rod Model224干燥器。
上述步骤可适应特定情况。可采用一个垂直板电泳装置，然而没有理由说水平板装置或圆盘电泳装置不能采用。许多参数都能改变而且在任何研究中都应考虑。例如，板的大小和厚度可以改变，分离胶的组成(浓度)可在5-12%范围内变化。采用浓缩胶是因为可获得较窄的带及很好的分离效果。
蛋白质样品通常以溶液的形式加样，但也可以加到滤纸上然后插入样品槽进行电泳。最近发现将5-10mg的组织，比如叶片，可以在两片缓冲液浸湿的滤纸间挤压然后再进行凝胶同工酶分析。
同工酶染色液通常按组织学染色技术设计。表9-4只列举了少数酶，但可供研究的酶很多。可参考Scandalios(1974)和Scandalios，Sorenson(1977)的综述。虽然这些方法已标准化，但还有待于进一步改进。天冬氨酸氨基转移酶就是如此，最近已发现一种更为灵敏和恒定的改进方法。
(三)核糖-1，5-二磷酸(RUDP)羧化酶的等电聚焦法
这种技术的利用依赖于能获得可提取羧化酶的绿色组织，然后进行等电聚焦，通过分析大小亚单位的带型来鉴定杂种后代。此法是根据Wildman和他的同事所设计的。仪器如同普通电泳。
1．叶片提取液的制备
①收集0．5g健全的绿叶，在蒸馏水中浸透。
②将叶片切成小片置于玻璃圆锥类的组织研磨器中。
③加1．3ml提取反应液(见表9-5)。在4℃下研磨不少于3min。
表9-5 等电聚焦制备RuDP羧化酶所需溶液成分
④8000×g离心15min，然后把上清液转入15ml厚壁的圆锥形管内。
2．RDuP羧化酶的沉淀收集
①向盛有约1．0ml叶提取液的锥形管内加入0．3ml抗RuDP羧化酶血清。这个比例对普通烟草可得到满意的沉淀效果。然而，其它系统的最佳比例要做预备试验杂确定。
②轻轻搅拌混合液，然后37℃保温数小时。在此过程中不可溶的RuDP羧化酶——抗体复合物便形成了。4℃下继续保温过夜。
③次日3000×g离心15min收集沉淀(使用带水平转头的离心机)。
④弃去上清液。沉淀排干水分数分钟后，将其悬浮于1ml冷的Borate-Saline缓冲液中(见表9-5)。如上再离心。
⑤重复步骤4。
⑥沉淀中的水分放干。盛沉淀的管立即充以N2气(充完气后立即用橡胶塞封住)，立即进行下一个步骤。
3．蛋白复合物的羧甲基化
①沉淀溶解于含5mg dithiothreitol(Cleland＇s reagent)的0．12ml Tris-尿素缓冲液(表9-5)中。重要的是加这个反应液及下面所有反应液时，用一个皮下注射器。
②把混合液在室温下放置2h。
③用铝箔包裹试管避光。
④羧甲基化的混合液通过一个小的Sephadex G-25(中级)柱，蛋白质用Tris-EDTA缓冲液洗脱(表9-5)。
⑤洗脱液用24%三氯乙酸(w／v)试验以检测蛋白质。当蛋白质出现时，收集0．7ml样液进行等电聚焦。
⑥Sephadex G-25的制备如下：取4g放入经抽气后的蒸馏水中，置冰箱内过夜，达到平衡，或沸水浴内平衡1h。灌柱后用Tris-EDTA缓冲液平衡。可灌制3个5ml柱。可采用5ml的吸量管作柱。
4．等电聚焦
①液解25mg过硫酸铵于25ml溶液2中(见表9-6)，制成5．25%聚丙烯酰胺凝胶，然后加入25μl TEMED和1．25ml混合好的载体两性电解质(即0．25mlpH3-10与1．00ml pH4-6)。取3．75ml溶液1(表9-6)，抽气后加到尿素溶液中。混合后立即倒入板中。将样品槽形成梳放入并小心在胶顶部覆盖蒸馏水，静置至少1h成胶。
②当使用胶时，倒掉蒸馏水，去梳。样品槽用水洗后注满蔗糖——载体两性电解质溶液(表9-6)。
表9-6 等电聚焦溶液
③加好电极液。使用这种仪器时，要注意加阴极液时不要扰动样品槽内的蔗糖——载体两性电解质溶液。
④加入足量的尿素至蛋白质样品中使其浓度为8M，然后转移样品(约20μl)至槽内，置于蔗糖——载体两性电解质溶液的下面。
⑤聚焦电泳在4℃及下列电泳条件下进行：1W1h，2．5W2h，最后4．5W2h。注意在最后2h内电压不超过800V。如果超过；将电源恒定在800V。
⑥5h后关闭电源。凝胶在右上角做上标记。pH曲线可用两种方法得到：或使用特殊设计的微电极，或切下1cm宽的胶条(从顶部到底部)然后切成0．5cm小段，每一段在1ml0．1M NaCl中平衡然后测定pH。
⑦凝胶的蛋白质染色，一般电泳用考马斯亮蓝G-250。
⑧结果记录也同前。
叶子的初步提取会产生一些严重的问题。如果提取混合液量不足的话，RuDP羧化酶的产量会很低。有的提取反应液不能使蛋白复合物沉淀。最后，因为多酚氧化酶的作用，叶提取液颜色变得很黑，产生一种很黑的沉淀，使得等电聚焦谱型由于变异带而难于解析。通过一系列试验后选用了这里描述的提取混合液(表9-5)。
直接沉淀方法基本上是Uchimiya等(1979)采用的。抗-RuDP血清是用来自健康(即无TMV病毒)的普通烟草的结晶RuBP羧化酶去免疫兔子。可使用Lowe(1977)提出的方法来结晶这种酶。制备酶的抗血清是采用Gray和Wildman(1976)的方法。这种羧化酶抗体的专一性似乎很广，从而可用来分离从来源很广的植物绿色材料的羧化酶。重要的一点是要用圆锥管在水平转头中离心，以得到管底部沉积很好的蛋白质沉淀。
羧甲基化步骤是简便直当的，但应注意下面几点。在操作过程中，排除氧气非常重要，所以充N2气是关键。沉淀物必须立即溶解于Tris-尿，因为沉淀物一经干燥，溶解起来就非常困难。使用的尿素必须是高度纯化的，因为尿素常被氰离子所污染。这将导致蛋白质Carbamyl衍生物产生而出现额外带。因为这种污染氰离子的情况，要尽可能快地(即数天内)完成这个试验是很重要。
(四)同工酶的聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦
在聚丙烯酰胺凝胶上等电聚焦与组织学染色识别酶相结合，似乎并未普遍使用，尤其在植物研究中。等电聚焦比普通电泳能得到更为显着的分离。这从培养细胞的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的研究得到证实。
所使用的仪器与普通聚丙烯酰胺电泳相同。提取液制备和蛋白质测定的步骤与普通凝胶电泳的相同。
1．凝胶制备
①6%聚丙烯酰胺凝胶由4．3ml溶液1(表9-6)用20．7ml蒸馏水稀释而制得。溶液抽气后，加入载体两性电解质，由0．25ml广范围pH3-10与1．0ml实用窄pH范围以及3．75ml溶液4(表9-3)组成。最后加入TEMED25μl。
②立即铺胶；插入梳并覆盖一层蒸馏水以排空气。胶在一荧光灯下光聚合，通常过夜或直至完全凝聚。
③电泳前将水除去，样品槽在灌入蔗糖-载体两性电解质溶液前先冲洗(表9-6)。蛋白质样品加至样品槽底部蔗糖-载体两性电解质溶液下面。
④电极室内注满合适溶液(表9-6)，三胆胺加至阴极室，谷氨酸加至阳极室。电泳条件如同RuBP羧化酶的等电聚焦。
2．凝胶染色
①电泳完毕后取出凝胶浸于蒸馏水中，保温在适合的酶缓冲液中(这溶液中无底物存在)轻轻摇动30min。
②凝胶置于染色液中使谱带出现。各种染色液的组成见表4。
③凝胶的pH曲线及其保存如前述。
等电聚焦后的凝胶通常用考马斯亮蓝使蛋白质显出；然而，这里的意图是鉴定各种酶系统。为此重要在于除去载体两性电解质，从而改变pH环境以适于酶反应进行。做法是用染色混合液所用缓冲液平衡凝胶；通常30min足够。
(五)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳用来分离和估测蛋白质的多肽链组成(亚单位)的分子量的。基本内容可参阅两篇论文。这种技术已被用来确定烟草、属核糖-1，5-二磷酸羧化酶的两个亚基的分子量。
这种技术仍是使用标准的凝胶电泳装置。
1．提取液的制备
①蛋白质样品提取和制备如前所述。按常规方式。
②电泳开始前将100μl蛋白提取液与等体积的解离介质(溶液1，见表9-7)相混合，解离介质中加有7．7mg二硫苏糖醇。在沸水浴中加热1．5min。做一个实验约需20-30μg蛋白质。
2．凝胶制备
①电泳胶由3．8g丙烯酰胺及76mg甲叉双丙烯酰胺溶解在21．4ml蒸馏水中制得。然后加入9．7ml缓冲液(溶液2，表9-7)，0．15ml过硫酸铵(溶液5，表9-7)，0．39ml SDS(溶液6，表9-7)，最后加30μl TEMED。
②立即铺板至合适高度(大约离顶端3cm)，形成胶的板在顶部定位并覆盖以一层溶液。这种溶液组成为：5ml溶液2(表9-7)，15ml蒸馏水和0．2ml溶液6(表9-7)。
③至少1h使成胶。
④浓缩胶制成后在临实验前灌入。其制法是0．51g丙烯酰胺与0．12g甲叉双丙烯酰胺溶解于10．1ml蒸馏水中。再加入3．75ml溶液3(表9-7)，0．18ml溶液5(表9-7)，0．20ml溶液6(表9-7)，和15μl TEMED。
⑤除去胶上面的覆盖溶液层，用蒸馏水清洗，然后用滤纸吸干胶表面。浓缩胶加至合适高度。将梳插入浓缩胶并盖以电极缓冲液(溶液7，表)。等20-30min胶凝后，慢慢取去梳，用电极缓冲液灌满样品槽。
⑥向样品槽内加入已准备好的蛋白样品。每次电泳都要已知分子量标准蛋白作比较用(这可以买到)。这种标准蛋白的样品制备同未知样品制备。
⑦在50mA恒流下，直至电压达到200V，然后继续电泳，直至指示剂前沿到达胶的底部(大约5h)。电泳在15℃下进行，否则SDS会沉淀。
⑧电泳结束时，关掉电泳，拆开电泳装置。在胶的一角作记号。
⑨将胶转移至溶液8(表9-7)，50℃至少需1h。胶可保存至过夜而无影响。除去染色液，用溶液9(表9-7)室温下浸泡几个小时。最后在溶液10(表9-7)中反复脱色(50℃)。
⑩未知蛋白谱带的分子量通过与标准蛋白质比较而确定。标准曲线是以R1对标准蛋白质的分子量作图于半自然对数纸上而获得。
表9-7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳用溶液
3．凝胶可干燥保存，并应拍照记录
SDS技术是比较简单明了的。蛋白质标准品在每次实验中都必须与未知样品同时进行电泳。这些标准品可作为标记物，这样未知样品中的蛋白谱带可与之比较。也应记住，这里的蛋白质是解离后的产物而非处于天然状态。这就是为什么这种方法不能用来观察同工酶的缘故，除非少数情况时，解离的分子可以回复原来自然状态，然后进行估定。
【参考文献】：
〔1〕Allen，R．and H．R．Mauer(eds．)1974 Electrophoresis and isoelectric focusing in polyacrylamide geli Advances of Methods and Theories．Biochemical and Clinical Applications，Walter de Gruyter，Berlin．
〔2〕Brewer，G．J．and C．F．Sing 1970 An Introduction to Isozgme Technoques．Academic Press，New York．
〔3〕Markert，C．L．(ed．)1975 Isogymes．Molecular Stracture(Vol．1)，Physio1-ogcial Function(Vo1．11)， Developmental Biology(Vo1．111)，Genetics and Evolution(Vol．lV)，Academic Press，New York．
〔4〕Righetti，P．G．and E．Gianazza1980 New derelopments in isoelectric focusing J．Chromatogr．184∶415-456．
〔5〕Scandalios，J．G．and J．C．Sorenson 1977 Isozymes in plant tissue culture．In：Plant Cell，Tissue and Organ Culture(J．Reinert and Y．P．S．Bajaj，eds．)pp．719-730．Springer-Verlag，Berlin，New York．
〔6〕Vesterberg，O．1973 Isoelectric focusing of proteins in thin layers of polyacrylamide gel．Sci．Tools，20∶22-29．
〔7〕Weber，K．and M．Osborn 1975 Pruteins and sodium dodecyl sulphate：Molecular weight determination on polyacrylamide gels and related procedures．In：The proteins(H．Neurath and R．L．Hill，eds．)pp．179-223，Academic Press，New York．