咖啡锈病评价
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第268页（4342字）
用咖啡叶盘培养Hemileia vastatrix Berk．& Br．，曾用于研究寄主与病原菌间互作-些特性。大田种植的咖啡植株对H．vastatrix的抗性反应，也在叶盘上有同样表现，由此能在实验室条件下进行筛选抗性种质的研究。组织培养技术使在浸有微生物污染的情况下建立离体咖啡叶与锈病真菌的联系。这种系统可用于保持人工培养H．vastatrix小种，并可提供对H．vastarix与植物寄主互作进行精确的生理研究的环境。
建立离体培养寄主——专性寄生物系统的最基本因素是要取得无菌的接种物。在夏孢子尚未从夏孢子堆释放出来前不久，即夏孢子堆发育早期，表面消毒植物被侵染的部位，由此从表面污染物中分离夏孢子。采用这种技术，可将咖啡叶外植体上保持的Hemileia vastatrix纯合培养物保持在离体培养中。
从表面消毒过的咖啡叶切取叶片外植体，只有从其成熟的病斑，方能得到无菌的H．vastatrix夏孢子。成熟病斑就是病斑发育超过黄斑点时期，在病斑中央有可识别的夏孢子出现。这种程序不同于前面所用的收集象以下一些锈病真菌的无菌夏孢子的方法，如Pucvinia spp，Melampsora lini，和Uromyves dianthi，是用黄斑点时期的叶进行表面消毒。H．vastatrix夏孢子堆的形态学研究表明，在表皮下面，菌丝迅速地水平伸展，并在气孔下空间中形成一簇或一小簇，这些簇菌丝或一小簇菌丝通过气孔开口，和在菌丝顶部直接地或特化基部细胞产生孢子。只能在宿主体外进行孢子的形成，并不引起保卫细胞和邻近细胞的破裂。在Puecinia，Uromyves和Melampsora这些种中夏孢子是突然进裂的。因此，当这些真菌引起的病斑，在黄斑点时期消毒时，造孢细胞仍然为表皮所保护。在H．vastatrix中，可能会推测，当在黄斑时期进行消毒时，菌丝顶部或特殊的基部细胞会直接暴露在消毒液中，很可能遭到伤害，从而使造孢过程停止。另一方面，当孢子堆成熟时，形成夏孢子簇(图12-3)，这明显地形成了一道屏障，保护孢子形成细胞不受伤害。
图12-3 在咖啡植株上获得Hemileia vastatrix Berk和Br·的无菌夏孢子的程序图解
程序从温室栽培的咖啡植株得到带有成熟咖啡锈病斑的叶片，叶片以次氯酸钠消毒。从叶片上分离下带有病斑的外植体。把外植体培养在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，检测污染情况，然后移到含有水琼脂培养基的瓶中。当病斑恢复孢子形成时，收集夏孢子样本，
移到PDA培养基上，检测侵染情况和生存性(图12-5)。将证明是无菌的能生存的孢子移到未受污染的咖啡叶片外植体上，咖啡叶片外植体培养在小瓶的琼脂培养基上。当接种处形成新病斑时，就可能保持得到连续的无菌接种物来源，方法是每个月把夏孢子从成熟病斑转接到无菌的咖啡外植体上。通常，孢子在每次转接时都要检查其活力及污染情况(图12-4)·
图12-4 在咖啡叶外植体上保持Hemileia uastatrix Berk和Br．纯培养体的图解
在咖啡叶外植体上获得纯培养的Hemileia vastatrix的详细步骤如下。
(一)咖啡植株接种
1．用骆驼毛刷将夏孢子转接到温室培养的咖啡植株的第二对或第三对新生叶上。
2．用喷雾器喷湿植株，然后密封在塑料袋中，以保持叶下表面上有自由水。
3．暗培，22-24℃条件下，植株培养72h。
4．除去塑料袋，将植株移到温室中的工作台上，长到形成成熟病斑，经4-7个星期发生。
(二)带有成熟病斑的叶的表面消毒
1．从接过种的植株上选择有成熟病斑的叶片。
2．以自来水将叶子洗干净，再以重蒸水洗涤(以下步骤应在超净台无菌空气过滤罩下进行)。
3．以1%的次氯酸钠进行表面消毒20min(20%的商品漂白粉)。
4．叶子在无菌重蒸水中浸洗三次。
5．以无菌刀片切取带有成熟病斑的叶外植体，周围留有3mm的健康组织。
(三)叶外植体的污染检测
1．切取带有成熟病斑的叶外植体，在25℃下，放在培养皿中培养48小时，培养基为马铃薯葡糖培养基。
2．把未污染的叶外植体转入30ml瓶中，瓶中装有10ml的1%水琼脂培养基。
(四)检测夏孢子的污染和活力
1．当叶外植体上的病斑转接到水琼脂培养基上重新开始孢子形成时，用无菌的解剖针的针尖从每一个病斑采集夏孢子的样本，转到马铃薯葡糖琼脂培养基上。
2．暗培，22-24℃条件下，将转接的夏孢子培养48h。
3．检查夏孢子的污染情况。
4．每一样本，用显微镜观察100个孢子的萌发情况(100倍)，五个可能的萌发管中至少要有一个超过5μm，方可计算孢子萌发。
(五)无菌条件下叶外植体的接种
1．用上述方法，对健康咖啡叶外植体进行表面消毒。
2．以无菌刀片切取叶外植体，象用上述方法，检测其污染情况。
3．将进行过生物检测的病斑的无菌有活力的夏孢子，用无菌解剖针转接到瓶中的琼脂培养基上的无菌咖啡叶外植体上。
4．接种后的外植体，暗培，22-24℃下，培养72h，然后转至每天12h光照的条件下(6000lx)。
(六)培养物的维持
1．每隔一个月，把接种的外植体(如上所述)上产生的病斑的夏孢子移到健康的无菌的咖啡叶外植体上，以保证不断得到无菌夏孢子的供应。
2．经常对夏孢子进行污染和活力的生物检测，以肯定是否为单直感培养体。
离体条件下筛选咖啡抗锈病植株的前途。
利用对植物病原菌产生的毒素的抗性，在培养中筛选得到的细胞已经再生抗病植株。利用真菌和寄主愈伤组织的双重培养来选择和繁殖抗性细胞系是可考虑的另一可能性。这已被建议用于抗Hemileia vastatrix的咖啡育种方案中，建议利用双重培养从抗锈病叶外植体细胞再生咖啡植株，可提供培育抗咖啡锈病的来源。除锈病真菌与愈伤组织培养外，最近综述过关于得到专性寄生真菌的双重培养体，但利用愈伤组织进行锈病真菌的双重培养并未得到相似的资料。H．vartatrix感染咖啡愈伤组织的尝试没有成功。愈伤组织接种后，夏孢子可在愈伤组织表面形成萌发管、附着胞、感染线、小泡和感染性菌丝，但都没有进一步渗入。愈伤组织培养基的成份应作改变，曾发现Puccinia graminis f．sp．tritici的锈病感染受到不同的生长激素组合和无机盐浓度的影响，应测试愈伤组织培养基成分。
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