低温保存法
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第280页（6312字）
(一)冷冻方法
对组织生活力来说，贮藏细胞内的水晶类型是很重要的。由此提出了三种不同类型的冷冻过程：(1)慢速冷冻法：温度下降速度为0．1-10℃／min。(2)快速冷冻法：温度下降速度为50-1200℃／min。(3)逐步冷冻法：先用慢速冷冻法使温度降至-20——40℃，然后放置一段时间，再用快速冷冻法降至-196℃(液氮中)。每种方法所用的温度概括于图13-1，这些方法的贮藏温度均在-70——196℃间，温度改变会导致水晶体积增大。
图13-1 不同冷冻步骤中的温度
1．冷冻材料预处理 温度对植物的影响取决于基因型和环境以及生理状况。在实际过程中，基因型是一不变因子，而另二个因子可根据不同情况发生改变。有些植物总是在同一温度下死去，如向日葵在-2℃下死去。而其他一些植物的生死，取决于变冷前的环境温度，如卷心菜生长在20-30℃下，若移到-2℃就会死亡；而在5℃下生长一周后，移到-7℃下才会死亡；如果继续在0℃下生长一周，移到-12℃下才会死亡。这种致死温度视培养温度而异的现象，称为锻炼。Levitt和Dear(1970)称第一类植物为敏感植物，而第二类能锻炼的植物为耐寒植物。在锻炼过程中质膜结构可能发生变化，蛋白质之间分子连接可由二硫键变为硫氢键。另外，蔗糖(0．15M或更高)及类似的具低温保护功能的物质也会积累。
锻炼过程作为一种预处理对组织培养物的冷冻也很重要。由于遗传因子和环境因子都有影响，没有普遍规律可循，因此要区别情况分别对待。另外，光周期过程也会增加研究工作的复杂性。
细胞内冰晶的出现与否，取决于所加入的低温防护剂，这种物质在固态时是不定形的非晶体。现已知低温防护剂(抗冻剂)作用各异(表13-2)。其中最常用的是DMSO(二甲亚砜)。
表13-2 几种不同作用的低温防护剂(Cinatl和Tolar，1971)
稀释的低温防护剂溶液(如5-10%DMSO)必须逐步加入，两次间隔时间至少5min，以防发生质壁分离，这一步骤必须在冰浴中进行，因为室温下将影响细胞和组织的生活力。在最后一滴防护剂加入后至冷冻前，应有20-30min的间隔期。
也可使用几种低温防护剂的混合液。Ulrich等(1979)和Finkle等(1980)将棕榈的胚性愈伤组织块放入含10%聚乙二醇，0．44M葡萄糖和10%DMSO的混合液中，冷冻后愈伤组织仍能长出植株。
2．慢速冷冻法 这是最常用的一种方法，活细胞以-0．1-10℃／min的速度缓慢冷冻，这对脱水有益，能使细胞间冻结的水分减至最少。
已有许多温度控制仪包括有计算机编译系统的冷冻机。这些仪器很贵，但确使许多物种保存获得成功。Oryza Sala等(1979)在进行慢速冷冻时使用了较便宜的杜氏(Dewar)瓶。
3．快速冷冻法 冷冻得越快，细胞间的冰晶就越小。将植物材料放入小瓶中直接投入液氮，温度下降速度可达-3000——1000℃／min，甚至更快。这种方法简易，当装有植物材料的小瓶放在液氮上的空气环境中时，温度下降速度有所减慢(-10——70℃／min)。也可用干冰(CO2)代替液氮。
用于快速冷冻的低温防护剂的使用方法与慢速冷冻法相同。使用何种冷冻法决定于样本中水分含量，一般含水量低的小样本似乎用快速冷冻法适宜。在所有快速冷冻保藏报告中，都没有认为其解冻后的质壁分离的复原差于慢速冷冻法。
4．逐步冷冻法 这种方法集上述两种方法之长。用慢速冷冻使温度降至-20——40℃，使细胞保护性失水，然后在液氮中快速冷冻，以防在重要的生化结构间形成大冰晶。此法也需要低温防护剂，用法与前述相同。
逐步冷冻法对悬浮培养体很为理想，但对有结构的组织并不适宜。
(二)植物材料和设备
1．植物材料 对每个物种来说，许多类型的组织均能用于冷冻。经常采用愈伤组织，尤其是热带植物的愈伤组织。愈伤组织在继代一段时间后(一个或一个多星期，取决于生长率)，处于健壮的，快速生长时期，这时对冷冻危害抗性最强。在取材时，要避免取那些愈伤组织顶部的老化变黑的细胞。愈伤组织培养物会显出不同的生长习性，因此在实验操作时，要用不同的继代技术。愈伤组织长成大而易碎的团块，则应切成小块，否则它们可能增殖成松散的结合块，或者在琼脂上长成纸状薄层或粘稠状团块。对高度含水的品系(如许多禾谷类)可用刮勺，将愈伤组织刮在一起，然后继代。另外，对某些培养物或某些情况下用瓶中或试管里悬浮培养的植物材料，则用大头吸移管转接的效果较好。
2．培养基和清洗液 Murashige和Skoog(MS)培养基或者对所取组织适合培养的培养基，均可使用。禾谷类培养常用MS基本培养基，另加生长素2，4-D(4．5μM)和IAA(5．7μM)，以及细胞分裂素KIN(4．6μM)、L-谷氨酰胺(1mM)和蔗糖(0．037M)。制成固体培养基，可在消毒前加1%琼脂。
解冻后用来清洗样本中的低温防护剂的简单无菌清洗液，它只包含MS大量元素和0．87M蔗糖。
3．低温保护剂溶液 许多单一的化学物质或它们的混合物均被用过，其中最有效的是PGD溶液。该溶液包含有聚乙二醇(PEG6000，10%w／v)、葡萄糖(0．44M)和二甲亚砜(DMSO，10%)。
4．仪器 无菌转接需要用一个灭菌的或有气流装置的通风柜(超净台)。
(1)培养室中温度控制 对于悬浮培养体还需要有摇床，以利通气和瓶中溶液的搅拌。
(2)用于组织冷冻的试管 需用厚壁的，用硼酸玻璃(派热克斯玻璃)制成的12ml的锥形离心管，其上要有刻度，瓶有螺旋帽或者用重铝箔(100μm厚)盖住。也可用几种型号的带有塑料螺帽的冷冻小瓶。玻璃试管上的刻度有利于在实验中做到基本定量或者可以估计出所装细胞溶液的体积，而塑料小瓶具有占用贮藏面积较小的特点。
(3)吸移管 灭菌的长头吸移管，长约20cm，顶上装有橡皮球，在进行愈伤组织样本处理时，可用它来滴加或移去溶液。
(4)试剂瓶 应能高压消毒，用于装有少量的无菌液(如加入到样本中的清洗液)。
(5)冷冻设备 冷冻既可以在不同温度(-10，-15，-23，-30℃)的冰浴中逐步进行，每种温度处理4 min；也可以在连续变化的冷冻浴中进行。这种冷冻浴浸渍于冷却器内，其内装有广泛使用的简单化合物所组成，或者就是一种较为复杂的调控仪。温度下降速度为1-3℃／min以及在-4——10℃温度下逐步形成冰块，这种处理，组织复活率较高。
液氮瓶、附属小的液氮盛器(双层壁的Dewar杯或瓶)以及液氮样本贮存器是必需的，以便于在-196℃下进行组织处理和贮藏。
(三)冷冻贮藏程序(表13-3)
表13-3 冷冻、解冻及植物细胞鉴定步骤概要
1．组织预处理 水稻的愈伤组织在继代后1-2周，在灭菌柜条件下将松散组织刮在一起，然后用角匙将适量的组织转接到置于冰块中的培养皿里。细胞的体积为5ml或更多，要根据实验和繁殖需要而定。对于不同的实验处理，每个样本至少含有0．2-0．5ml的压紧细胞，量大的组织也许较难处理或者冷冻和解冻对其不起作用。如果操作仔细的话，碎冰块无需经过灭菌，并小心地混合培养皿中的细胞里，然后把它们均匀地分成几堆。如果用作不同的实验处理，可将其中一些转接到单独的培养皿中。
在装有组织的6cm直径培养皿中，按下法加入低温防护剂：首先在0℃下加入3份(相对于压紧细胞的体积并稀释4倍的PGD，轻轻搅拌，10min后用吸移管吸去液体。重新把细胞分成几份，一份为一样本。将每一份移入带有标签的、冷冻的冰箱中的小瓶里，每瓶中加1ml冷的原先浓缩的PGD。
2．冷冻处理 从结冰温度下的样本开始，或者将样本放入-10℃的冰浴中，或者放入冷冻调控仪中，将干冰块(固体二氧化碳)压挤入冷冻试管外的冰浴中，以人工进行结晶，直至内部冰晶形成。如果用冷冻调控仪，则把温度先调低一会儿(如-50℃)。如果用液氮蒸气流冷冻样本，只需瞬时就可以使试管中溶液结冰，而不必过渡冷冻愈伤组织细胞。结冰以后，按照冷冻步骤继续冷冻试管，当样本达-30℃时，转入含有液氮的Dewar瓶中短期或长期贮藏，直到需将愈伤组织解冰。在实验过程中，也许需要将一些样本在-196℃以上，如-15℃和-30℃就取出或解冻。
3．解冻处理 在解冻处理中需注意如下几点：将样本管的冷冻部位插入温水中，并用力振荡，直到冰块消失，但要保护样本管头部避免撞击而损坏。如果用玻璃试管，最好用40～45℃的水浴，而塑料管则用60℃。当冰融化后，试管不能再放在很热的水浴中，这对组织存活是很重要的。在刚解冻时就应马上将试管转移到室温水浴中(室温20-25℃)，并继续振荡15s，以使试管壁冷却，然后将试管暂时置于室温下，直到要准备清洗和转接培养。
4．再培养 将含有1mlPGD以及悬浮组织的试管通过火焰灭菌(仍在灭菌柜中操作)，然后用吸移管或标准试剂瓶，在室温下于每一试管中逐个加入0．5ml的蔗糖清洗剂(50%稀释度)，并轻轻旋转，10-15min后，用吸移管吸去液体，再加入1ml进行清洗再移去，接着用吸移管头部将细胞拨到试管壁上，使其沥干并便于其后的转接。
用两把刮勺将愈伤组织细胞转接到琼脂板上，其中一把勺要用不锈钢或铝箔铸成匙形，使组织转接时较方便，并可准确转接一定体积的愈伤组织。用一深的培养皿(25mm)内加入50ml琼脂培养基培养愈伤组织，通常这比在一般浅的(15mm)培养皿中的长得要好，尤其当几块愈伤组织样本在同一平板上时，效果更为显着。用双层的石蜡膜或用可透气的薄膜将培养皿的边缘包捆起来，将平板放在一起，可尽量减少污染和培养体中的水分损失。另外，如用悬浮培养，可将清洗了的细胞转接入试管或瓶中的营养液中，放在摇床上培养。
5．生活力和再生力的鉴定 尽管有比色法和其他化学方法能鉴定处理细胞的生活力，但再生长才是鉴定活力的最终目标。对于愈伤组织，可通过测定其大小、重量、或者在某些情况下可通过生长细胞或长成植株的数目来鉴定。对于细胞悬浮培养体，通过在有刻度的试管中样本离心后，测出压紧细胞的体积，同样可以测出细胞的生长能力。
若实验需要比较愈伤组织的大小和重量时，则要待愈伤组织生长一段时期，并用切取同样大小的组织块进行处理，培养在相同的合适条件下，这样处理较正确地区别它们的生长能力。
【参考文献】：
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