燕麦
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第471页（10520字）
栽培燕麦(Avena sativa L．)是野生燕麦Avena fatua的主要现代衍生种。古代记载指出燕麦栽植起源于小亚细亚，然后扩展到欧洲和其它适于栽培地区。罗马人(公元前250至公元50年)和希腊人(公元前400-200年)普遍熟悉燕麦属(Avena)。
燕麦是一种重要禾谷类作物，是家畜饲料和人们食粮。其籽粒含蛋白质12%和主要维生素。苏联总产额占全世界的40%，美国、加拿大、中国和西德是主要生产国。适栽于冷湿气候，由于品种很多，适应的气候条件很广泛。USDA(1980)档案中记载着5000个燕麦品种。
燕麦属染色体数可分3群，全以n=7为基数，包括二倍体(2n=14)，四倍体(2n=4x=28)和六倍体(2n=6x=42)。后者是商品燕麦。
组织、细胞与原生质体培养技术，主要在双子叶植物取得巨大进展，禾本科和豆科植物，由于在人工培养下，生长速度低和其原生质体难于操作，进度有限。本章叙述燕麦的生物技术发展状况，和原生质体和细胞培养的问题与潜力。
(一)原生质体培养
原生质体突出地适用于植物生长和发育试验，尤其包括试图应用遗传改变。这些裸露细胞的最重要优点是：(1)植株多数部分以及细胞悬浮体和愈伤组织可分离出大量完整的、一致的有生活力原生质体。(2)在适宜培养基上，原生质体能再生细胞壁，分裂形成愈伤组织，再生成完整植株。(3)原生质体能融合，其产物可经培养产生杂种。现已取得了新奇杂种如番茄+马铃薯。(4)由于它没有细胞壁，可经胞饮作用吸取外供颗粒，如核、叶绿体、染色体和病毒颗粒等等。因此成为产生新型植物的新途径。
Takebe等(1971)首次证实了烟草叶肉原生质体的单个原生质体的全能性。以后，以茄科种为主，许多种的原生质培养成功，再生完整植株。相反，禾谷类原生质体培养极困难。试图诱导禾谷类原生质体分裂，大都失败，尽管采用了大量不同供材和培养条件。只有少数植物能以继续分裂(表20-9)，Flores等(1981)发表了讨论文章。用活跃生长中细胞和组织培养体和大多数禾谷类植株的许多部分能分离出原生质体，但只有叶能取得高产原生质体。在适宜培养基上，它们一般能再生细胞壁，但常不能分裂以形成愈伤组织(Potryrus等，1976；Carlson，1978)。最近，Vasil与Vasil(1981)取得禾谷类珍珠粟和陈等(1984)取得水稻原生质培养再生植株成功。
表20-9 培养的原生质体能继续分裂的禾谷类植物的种
* 再生了植株
最近Bhojwani等(1977)，King等(1978)，Pental与Gunckel(1979)，Potrykus(1980)评述了作物的原生质体技术学。本文着重于燕麦叶肉原生质体培养最重要概况。
1．用于分离和培养的程序 采用生长在控制生长室的燕麦(品种Garry，Lodi和Victory)5-7日龄幼苗的第一叶原生质体分离与培养。在超净工作台上进行全部操作。
(1)把叶浸入70%乙醇消毒2min。无菌蒸馏水淋洗叶3次，放入加吐温-20(1滴／10ml)的10%商品漂白粉中5min，最后用无菌蒸馏水淋洗5次。
(2)用细弯头镊子撕去下表皮。去皮面向下将叶漂在0．5%(w／v)Cellulysin(B级，Calbiochem)溶于B5培养基，或1mM磷酸盐缓冲液(pH5．8)加0．4M山梨糖醇或0．6M甘露糖醇，30℃±1℃，2h，装在15×100mm培养皿中。这些处理能释放约106原生质体／克鲜重。必须在剥去表皮后立即放进酶溶液中，否则由于Cellulysin引起原生质体释放的抗力。
(3)用巴斯德吸移管从培养皿轻轻吸取原生质体悬浮体。轻倒进离心管，用石蜡膜封口。
(4)离心50×g5min。用培养基轻轻再悬浮洗原生质体片状沉积物几次，再离心，或经蔗糖(0．6M)缓冲器(cushion)离心。
(5)用B5+2，4-D，NAA，BA和其它附加物再悬浮原生质体，浓度约3×105原生质体／ml。
(6)原生质体悬浮在2mlB5，加等量B5+1．2%Ionagar(Colab Laboratories，Inc．Illinois)相混合(温度45℃)。把原生质体倾入玻璃培养皿。另一方法，用薄层培养原生质体悬浮体，或在15×60mm培养皿中加20μl微滴，每皿6-8微滴。
(7)培养皿用石蜡膜封边。
(8)培养在湿室内，22℃，扩散光或暗培。像其它大多数禾谷类原生质体一样，在这些条件下，燕麦叶肉原生质体易变和溶解。多数原生质体确能再生细胞壁，用荧光增白剂观察，呈碎片状和不规则。这类原生质体只出现有限的和零星的细胞分裂。至今，任何禾谷类在任何培养基上，叶肉原生质体未能发生持续细胞分裂。
2．燕麦原生质体不能细胞分裂的理由 禾谷类(包括燕麦)原生质体不能持续细胞分裂的原因，概述如下：
(1)遗传因子 上述禾谷类植物原生质体细胞分裂失败，指出原因在亲本组织的遗传性质。其愈伤组织生长慢以及再生植株频率低(与双子叶植物相比)支持着这种观点。禾谷类叶和大麦、水稻叶诱导愈伤组织已获成功。Kaur-Sawhney等(1980)研究燕麦叶肉原生质体结果，提出不分裂可能由于DNA合成破坏，原生质体停留在G0-G1阶段。禾谷类原生质体与双子叶的融合，以消除这种破坏，进一步支持着由于遗传因子而使有丝分裂失败的假说。
(2)伤害 分离原生质体不会不发生某种伤害。首先必须从植株上切取叶，切成小段。然后分段剥去表皮，漂在高渗培养基上进行质壁分离。最后暴露在多少不纯的诸酶中。凡此必定引起组织产生不同程度伤害，能导致迅速衰老，由于RNase和蛋白酶活性增大，RNA和蛋白质合成率降低，叶组织失去叶绿素，禾谷类叶更为敏感。
原生质体分离前的质壁分离，引起水分亏缺，从而可能产生脱落酸和乙烯水平增高。已知这些物质仰制细胞分裂。严重的质壁分离破坏胞间联丝，结果造成RNase漏入培养基，使原生质溶解。还能改变横过膜的电位，从强负到稍正(Racusen等，1978)。由于而不能再生匀称的细胞壁，如用增白剂染色所示结果。只有回复到负横过膜电位后，烟草原生质体才能再生细胞壁和细胞分裂。
(3)改进燕麦原生质体培养 燕麦叶肉原生质体分离时破碎，通常在培养24h内溶解。它们的标记前导物渗入蛋白质和RNA的能力，保持恒定几小时，此后迅速下降。再者，原生质体不能合成DNA，由于胸核苷不掺入真正DNA(为DNase所水解的)。这种观察结果与罕见有丝分裂活动，指出它们停止在细胞周期的G0-G1阶段。培养中很快衰老的这些原生质体，在分离原生质体前，用已知衰老抑制剂如激动素和放线菌酮预处理叶，可使稳定。还可使分离的原生质体里的RNase和蛋白酶活性降低，净RNA和蛋白质合成增高。最近Kaur-Sawhney发现自然产生的聚胺〔腐胺，刀豆氨酸，精脒，精胺(第二性征激素)〕及其前导物L-精氨酸和L-赖氨酸能使原生质体稳定(不受溶解)和增高有丝分裂活性。
用1-10mM聚胺预处理叶外植体或用含聚胺的培养基中分离，其大分子合成率增高。在无菌微滴培养体中加1mM刀豆氨酸或精脒，观察到真正DNA合成，精脒也能推动有丝分裂，增加二核体频率。这种二核原生质体不能进行胞质分裂，不继续发育。
动物细胞培养常见聚胺含量与分裂能间的密切关系。植物系统中，聚胺对嫌气细胞活性和防止衰老有重要作用。叶内聚胺的内在水平和其生物合成关键酶，随叶年龄增大和离体叶衰老而降低。聚胺虽是有效衰老抑制剂，以及改进燕麦原生质体培养的有希望手段，在燕麦原生质体里建立细胞分裂和聚胺生物合成的最适条件尚待研究。Kaur-Sawhney最近发现处在0．6M甘露糖醇中的禾谷类叶的腐胺滴定度迅速而巨大增高1，2-二氨基丁烷。这是由于精氨酸脱羧酶(ADC；EC4．1．1．19)合成增高。我们不知道腐胺形成是否与愈伤组织征状的表达及其防止有关。
(二)组织培养
1．愈伤组织形成 近几年来，某些禾谷类作物外植体诱导愈伤组织和植株再生进展很快。但燕麦外植体与悬浮培养物愈伤组织诱导成果不多。Wetster(1966)和Carter等(1967)最早从事燕麦愈伤组织诱导。二者都以发芽中种子为供材，在加2，4-D培养基上取得最大生长。Webster(1966)用Heller培养基附加IAA，NAA和2，4-D能使愈伤组织在几次继代中保持稳定。Carter等(1967)用LS附加诸生长素的复杂混合物与激动素，从种子取得有生活力愈伤组织。结论是诱导愈伤组织有赖于生长素(IAA与2，4-D)，而不是KIN浓度。事实上，KIN高浓度抑制愈伤组织生长，细胞分裂素一般对禾谷类效果比其它作物为差。启动愈伤组织所需IAA浓度，一般比2，4-D要高得多，22．5-225μM2，4-D愈伤组织生长最好。Brenneman与Galson(1975)用燕麦品种Garry与Victory幼苗根和下胚轴组织，培养在LS+高浓度生长素(22．5μM 2，4-D)诱导了愈伤组织形成。当将愈伤组织从供试外植体上取下，反复继代，在低水平生长素(IAA或NAA)或加细胞分裂素(BAP，IBA或KIN)培养基上，能诱导生根。在改进的LS上，发生了亮绿瘤和类分生组织无根，根可形成代替绿瘤。瘤的解剖观察，指出有假导管和分生组织活跃细胞，但罕见有规律的和功能排列的维管束。产生了一些典型根，但即使是茎状瘤，未能发育成典型芽(茎叶)。
2．器官建成与再生 表20-10汇综了燕麦愈伤组织诱导和植株再生结果。一般言之，愈伤组织启动和植株再生以未成熟胚最好；可是，植株再生也能从穗轴、茎尖和根培养取得。外植体类型和年龄对决定愈伤组织诱导有重要性。
表20-10 燕麦愈伤组织诱导和植株再生
为了从未成熟胚取得愈伤组织诱导和再生的最好效果，盾片必须向上；用成熟幼苗，以向下较好。适当外植体培养在MS+2，4-D；以产生全能性愈伤组织，NAA+2ip增高愈伤组织生长。将生长中愈伤组织转移至无2，4-D培养基上，足以诱导生根，有时芽再生。
Cummings等(1976)可能是首次从未成熟胚启动愈伤组织和植株再生取得成功，采用许多基因型的外植体培养在B5或MS+2．3-13．5μM 2，4-D取得的。这些培养体保持和继代在B5+4．5μM 2，4-D。品种Lodi的愈伤组织保持1年半经13次继代，未见再生植株能力的消失。采用B5不加2，4-D诱导器官分化，90%再生植株移栽成活。多数植株生长旺盛，产生种子，有不育的和高生活率的。多数再生植株正常，也有表型和基因型变异性。从白化至斑叶植株和芒和抽穗类型差异。也观察到染色体不稳定性。发芽中胚和茎尖分生组织培养在B5+2，4-D取得能再生植株的愈伤组织。
Loerz等(1976)从三个燕麦品种(表20-10)的下胚轴培养在SH+2．3μM2，4-D诱导愈伤组织成功。将2，4-D增至9．0μM，其生长率增高。用适宜平衡的生长素与细胞分裂素，在第8次继代诱导产生了器官建成。IAA-KIN或NAA-BA-GA3组合启动生根，NAA 3．0μM+IAA 10．0μM+BA 1．5μM取得根和芽(茎叶)。50%以上愈伤组织产生芽，当培养在40001x，光周期16：8h下，每块愈伤组织产生1-5芽。取无根的芽转移到无荷尔蒙MS上，生了根。Galston等(1977)和作者用稍加改进的Cummings等(1976)技术，从成熟胚盾片成功地诱导产生旺势愈伤组织器官建成。最近作者从分蘖的侧芽产生的愈伤组织有效地产生了再生植株。
(三)用于愈伤组织形成的培养程序
1．去壳燕麦种子浸入商品漂白粉∶水(1∶2v／v)乳液中，消毒15min。用无菌蒸馏水淋洗几次，吸干，放在25×100mm培养皿内的湿滤纸上。
2．放在培养箱内，暗培，24℃，约18h。
3．用无菌工具从吸涨种子取出完整胚。将盾片向下，接种在愈伤组织诱导培养基上，MS或B5+2．3——23．0μM 2，4一D。
4．在控制的生长箱内培养，23℃，扩散光。约经6周愈伤组织形成。
5．每隔4周用新鲜培养基继代一次。
6．转移到B5+2．3μM 2，4-D。启动多绿色中心的器官建成，具有圆筒茎状性质。切取这些中心培养(带些愈伤组织)，分化成根和芽。
7．再生植株移栽
石，含有矿质营养溶液。放在控制条件生长室内，23℃，18h光照，光强约12000lx。发育成正常燕麦植株。胚年龄、盾片大小或启动培养基中2，4-D浓度对植株再生是否是关键因素，还不清楚。
这些最近试验证实了燕麦和其它禾谷类可取得愈伤组织诱导和植株再生。但培养基最适条件和环境，化学因子，对任何种取得再生植株成功，尚未充分了解。
(四)问题与展望
最近报道了禾谷类组织培养再生完整植株成功，但是散发性的，多少不能重现。曾用许多种做过尝试，从狼尾草的未成熟胚悬浮细胞培养体产生的原生质以及水稻原生质体成功地诱导植株再生。
作者把禾谷类原生质体细胞分裂失败试图归之于遗传因子和／或原生质体在分离期间对损伤或渗透性亏缺敏感。这种推测是基于在相同试验条件下，其它植物种原生质体相对地易于发生细胞分裂的事实作出的。禾谷类培养成功较少，关于测定与细胞衰老(能阻碍细胞分裂)有关的各种代谢事项已取得实质性进展。包括RNA和蛋白质合成速率降低，和RNase和蛋白酶活性增高。用特定衰老抑制剂，如聚胺和细胞分裂素处理，结果能稳定原生质体不被溶解，防止了RNase和蛋白酶活性增高，以及降低大分子合成速率。聚胺在刺激DNA合成后，也能诱导至少一次有丝分裂。可惜，这些原生质体不进行胞质分裂，因此仍保持双核状态。由此可知聚胺能引起G1-S转变，仅如此而已。深入了解最适细胞分裂及其控制的代谢过程，必将有助于禾谷类原生质体培养成功。
Cure与Mott(1978)从事燕麦和其它禾谷类培养组织体中器官建成的解剖研究，指出其芽再生可能由于在根上产生不定芽，而不是从未分化愈伤组织控制就地产生的器官建成。此外，只有玉米、小麦、高粱和燕麦的某些基因型的某些外植体(表20-8)有产生组织化能力，强调着我们对禾谷类再生基础缺乏了解。
涉及产生细胞纯系以改良禾谷类作物中值得注意的另一问题是染色体变异。禾谷类花药培养虽能取得再生单倍体植株的某些成就，尤其是水稻，燕麦仍极困难。这就尤为可惜，由于单倍体植株作为有用突变之源，供作物改良利用，十分引人。花药培养产生单倍体植株技术学，有其自身的难点，其中许多许多变异体，包括白化苗。为了组织培养技术学的有效应用于禾谷类改良，这些问题需更深入研究和了解。
【参考文献】：
〔1〕Carnhan，H．L．and H．D．Hill 1961 Cytology and genetics of forage grasses。Bot．Rev．27∶1-162．
〔2〕Heath，M．E．，D．S．Metcalfe and R．E．Barnes 1973 Forages∶The Science of Grassland Agriculture．3rd ed．Iowa State Ulniv．Press，Ames．
〔3〕Larkin，P．J．and W．R．Scowcroft 1981 Somaclonal Variation-Anovel source ofvari ability from cell cultures for plant improvement．Theor．App．Gonct，60∶197-214．
〔4〕Schenk，P．J．and A．C．Hildebrandt 1972 Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell caltures，Can．J．Bot．50∶199-204．
〔5〕Thomas，E．，P．J．King and I．Potrykus 1977 Shoot and embryv．like structure formation from cultured tissues of Sorghum bicolor．Naturwissenschaffen 64∶587．
〔6〕Brenneman，F．N．and A．W．Galston 1975 Experimentson Cultivation of protoplasts and calli of agriculturally important plants．1．Oats(Avena Sativa L．)．Biochem．Physiol．Pflanz．168∶453-471．
〔7〕Cummings，D．P．，C．E．Green，and D．D．Stuthman 1976 Callus inductionand plantregeneration in oats．Crop Sci．16：465-470．
〔8〕Flores，H．E．，R．Kaur-Sawhney and A．W．Calston 1981 Protoplasts as vehicles for plant propagation and improvement．In∶Advances in Cell Culture(K．Maramorosch，ed．)pp．241-279，AcademicPress，New York．
〔9〕Galston，A．W．and K．Kaur-Sawhney 1980 Polyamines and plant cells．What’s New Plant Physiology，11∶5-8．
〔10〕Loerz，H．，C．T．Harms，and I．Potrykus 1976 Regeneration of plants from callus in Avena sativa L．Z．Pflamzcnziiecht．77∶257-259．
〔11〕Dunstan，D．L．，R．C．Short，H．Dhaliwal and E．Thomas 1979 Further Studies of plantlet production from cultured tissue of Sorghum bicolor．Protoplasma 101：355-362．
〔12〕Green，C．E．and R．Phillips 1975 In vitro Plant regeneration from tissue cultures of maize．CropSci．15∶417-421．
〔13〕Lu，C．Y．，V．V asil and I．K．Vasil 1981 Isolation and Culture of protoplasts of Panicum maximum Jacq．(Guines grass)∶Somatic embryogenesis and plantlet formation．Z．Pflanzenphysiol．104∶311-318．
〔14〕Vasil，V．and I．K．Vasil 1980 Isolation and cultrre of cereal protoplasts，Part2．Embryogenes and plantlet formation from protoplasts of Pennisetum american umn Theor．Appl．Genet．56∶97-99．
〔15〕Vasil V．1982 The ontogeny of somatic embryos of Pennisetum americanum(L．)K．Schum．I．In：caltured immature embryos．Bot．Gaz．143∶454-465．
〔16〕Bingham，E．T．1980 Maximizing heterozygosity in autotetraploids．In∶Polypl-oidy Biological Revevance(W．H．Lewis．ed．)pp．471-489，Plenum Press，New York．
〔17〕Hurley，L．V．D．M．Kantz and J．W．Saunders 1975 Breeding alfalfa Which regenerates from callus tissue culture．Crop Sci．15∶719-721．
〔18〕Kao，K．N．and M．R．Michayluk 1980 Plant regeneration from mesophyll protoplasts of alfalfa．Z．Pflanzenphysiol．96∶135-141．
〔19〕McCoy，T．J．and E．T．Binghim 1977 Regeneration of diploid alfalfa plants from cells grown in suspension culture．Plant Sci Lett．10；59-66．
〔20〕Walker，K．A．and S．J．Sato 1981 Morphogenesis in callus tissue of Medibago sativa．The role of ammonium ion in somatic embryogenesis．Plant cell，Tissue and Organ Culture．1∶109-121。