柑桔
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第567页（11158字）
柑桔属(Citrus)属芸香科(Rutaceae)。Barrett与Rhodes(1976)最近分类鉴别出可食柑桔只有三个种：宽皮桔(C．reticulata Blanco)；柚子(C．grandis Osbeck)和香橼(C．medica L．)提出其它栽培种间关系，设想是酸橙和柠檬是三个种的杂种，即香橼，柚子和microcitrus，柠檬具有较大比例的香橼基因；酸橙和甜橙是宽皮桔与柚子的杂种。亚洲是真正柑桔果树原产地。生长于全球热带与亚热带地区。纵跨南北纬40°之间。柑桔属通常是二倍体性。体细胞染色体数2n=18。有少数天然四倍体和三倍体。四倍体无经济价值。柑桔遗传复杂，由于珠心胚性发生、异质性、自交不亲和，不育性、世代循环长。珠心胚性发生是杂交的重障碍，但能产生旺势、一致性、无病毒砧木。孤性生殖为选择无籽柑桔有所贡献。
(一)研究进展
1．体细胞胚胎发生 Maheshwari等1958年用受精前和后不同发育时期胚珠和种子启动培养。Rangaswamy(1961)和Subharwal(1963)培养充分发育的珠心胚外植体产生更多胚和愈伤组织。Ohta等(1957)报道可能来源于珠心的成熟柑桔胚。Rangan等(1968)和Jaarez等(1976)用单胚柑桔栽培品种的珠心，诱导产生珠心胚，目的在于从单胚发生栽培品种产生无病毒类型。
Maheshwari等(1958)设想只有受精胚珠对培养条件发生反应，Bitters等(1970)，Button等(1971)，Kochba等(1972；1973)证实了未受精胚珠的珠心外植体也能取得珠心胚。Kochba等(1973)和Mitra等(1972)从未受精胚珠和珠心取得胚性愈伤组织。Mitra等(1972)观察到长期继代，胚胎发生下降和停止。Kochba等(1972)11年前取得的Shamouti橙橙愈伤组织，仍能保持胚性发生的竞存性。
柑桔珠心细胞与咖啡叶组织不同，是予决定为胚性细胞的，诱导体细胞胚胎发生通常不需要荷尔蒙。但是，Eureka和Villafranca柠檬和密切有关的C．volctameriana的珠心和胚珠外植体诱导再生植株，需加2，4-D以取得胚胎发生愈伤组织。各种柑桔种和栽培品种的珠心和胚珠外植体培养在MS不加植物荷尔蒙，但加500mg／l麦芽浸出液，产生愈伤组织。Tisserat等(1979)综述了人工培养柑桔无性胚胎发生资料。
Vardi等(1982)从柑桔属9个种和栽培品种取得胚性愈伤组织。用Microcitrus属诱导了愈伤组织和原生质体培养物(Vardi等，1983)。珠心和胚珠组织诱导出愈伤组织，愈伤组织产生了悬浮培养物和单细胞。珠心愈伤组织产生的原生质体能在离体培养再生。柑桔病珠心培养的普遍现象是植物荷尔蒙自养，用2，4-D启动诱导产生的培养物(Villafrana和Eureka柠檬)也观察同样现象。
Button等(1974)研究Shamouti橙珠心愈伤组织胚形成。这种愈伤组织似乎由粗糙球形细胞簇组成，为外被细胞壁。内部细胞有许多胞间联丝连合着。后来细胞增大，细胞簇解散成新分生组织中心。愈伤组织增殖，继续出芽产生新球形体。在胚性发生条件下，颗状体小，外层和内部细胞形成胚。
内部生长素浓度高，限制着体细胞胚胎发生频率。柑桔愈伤组织的自养生长习性指出，生长素和其它生长物质内生水平足够的高。外加IAA，NAA或KIN，BA，2iP抑制胚胎发生，另一方面，生长素合成抑制剂如HNB(5-溴化羟亚硝酸苯)和AZI(氮杂吲哚)和GA3合成抑制剂，如CCC和ALAR(琥珀酸-2，2-甲基-酰肼)，促进体细胞胚胎发生。
胚性愈伤组织把大部分IAA很快转变成IAA天门冬酸盐，是一种稳定复合体，由此组织内的过多IAA。相反，非胚性细胞形成很少IAA天门冬酸盐。
低ABA0．04-4．0μM和低2-氯乙基磷酸0．07-7．0μM胚胎发生明显增高。较高浓度乙烯可能抑制胚胎发生。
橙汁促进柑桔果实内果皮愈伤组织生长，抗坏血酸促进橙(C．sinensis cv．Navel)珠心组织形成球形胚。5．6-56mM抗坏血酸对惯性柑桔胚珠愈伤组织有毒。
麦芽浸出液(ME)有利于珠心培养体的胚胎发生，惯性珠心愈伤组织失去了胚胎发生对ME的依赖性。
深入研究各种糖类对Shamoati橙和其它五个系的胚胎发生和大胚发育。半乳糖和半乳糖产生的糖类(乳糖，棉子糖)相当大地促进胚胎发生。在蔗糖不存在时，这些糖类也能很好支持生长。半乳糖效应是否由于抑制生长素合成或影响乙烯发生，还不知道。Tisserat等(1977)观察到高水平ethephon对柑桔和胡萝卜胚胎发生抑制作用。供试糖类中，葡萄糖和果糖促进胚胎发生效果很小。半乳糖32mM以上，加IAA，KIN或GA3，结果产生不同程度的胚胎发生抑制作用。培养10周后，IAA抑制作用显着下降(与5周比较)。
愈伤组织年龄、不加蔗糖和γ射线对胚胎发生的影响已有报道。当一次性培养在无蔗糖培养基上，随之转入加蔗糖培养基，胚胎发生大大地促进。γ射线12-16KR照射Shamouti橙愈伤组织，促进效果最高。惯性愈伤组织，只有照射的愈伤组织促进了胚胎发生。辐射处理能降低内生生长素水平。用很高接近致死辐射剂量时，(30KR)，加IAA，柑桔培养体得以生存。
继代的珠心柑桔愈伤组织能长期保持其胚性潜势，珠心细胞的原有状态。有的培养体和趋性条件能抑制这种能力，有的解除抑制。选择愈伤组织的耐盐和2，4-D系取得同样论据。Shamouti橙若干愈伤组织细胞系和酸橙的一个细胞系，在高达0．17MNaCl上有生长能力。有些耐盐细胞系，在半乳糖存在下，得以再生，其它需要加半乳糖与NaCl组合的培养基。也选出耐2×10-4M2，4-D的三个系。其中一个系变成依靠2，4-D的，即当培养在2，4-D上，保留它们的胚胎发生能力。
广泛研究以求保证柑桔珠心愈伤组织和原生质体发育成胚和再生植株。详参看原生克隆。规定了四个阶段，GA3单用或与ADE相配合用，在胚性发育任何时期都能促进生根。
2．器官发生 柑桔愈伤组织培养体和愈伤组织形成，许多器官包括胚珠都能启动。但胚性发生能力，主要视外植体源而不同。
(1)内果皮和汁囊 从柑桔内果皮和柠檬汁囊取得了非胚性愈伤组织。
(2)茎和叶 Shamouti甜橙老树叶柄与枝间的脱落带取得愈伤组织形成。由于研究目的在于阐明生长调节剂和环境条件对芽发育的作用，而未进行进一步研究，以测定那种愈伤组织的分化能力。Grinblat(1972)首先报道胚珠和种子以外器官的芽形态建成。C．modu-rensis L．cv．Calamondin幼苗的茎切段外植体人工培养，产生愈伤组织、芽和植株。柚子、甜橙的茎和叶和葡萄柚，甜酸橙(C．limettoides Tanaka)的切段也取得了胚性愈伤组织。
(3)胚乳 细胞阶段(开花后约2个月)的胚乳取得了愈伤组织、胚和三倍体(3n=27)再生植株。柚子和甜橙的胚乳培养在2MT培养基加GA5．77-43．3μM。
(4)花药 Poncirus trifoliata L．Raf．单核期花药离体培养取得了单倍体再生植株(n=9)。酸橙(C．aurantium L．)花药培养只产生二倍体(2n=18)。
3．原生质体产生植株 柑桔属是原生质体培养成功的唯一木本植物。最初用Shamowti甜橙珠心愈伤组织。最早研究目的在于：1．创设原生质体分离和培养方法；2．完成从原生质体到植株全过程；3．诱变剂(如X射线和EMS)处理原生质体取得来源于处理的单细胞的植株。采用了饲喂培养技术，以取得最低植板密度的自身持续生长。X照射的原生质体和未辐照的原生质体植板在饲喂层上，增高了体细胞胚再生。这证实了Spiegel-Roy等(1973)的发现，辐照Shamouti甜橙胚珠愈伤组织促进着胚胎发生。其再生植株是二倍体。其中6株嫁接在酸橙上，长到结实期。自后应用于其它柑桔种，原生质体分离、培养、再生成有功能植株。
从新愈伤组织系原生质体完成再生植株全过程的有：1．甜橙Nacellar Shamouti，Sha-mouti Landau；2．酸橙；3．C．raticulata Blanco mandarin cv．Murcott，Dancy，Ponkan；4．葡萄柚 Duncan；5．柠檬 Villafranca。除柠檬外，其余愈伤组织培养都未引起多倍体性或非整倍性。这二倍体性值得注意，由于原生质体产生植株常是多倍体作用(例如林烟草)。柑桔的另一重要状态；在所有原生质体系统中，只有柑桔是生长素为原生质体分裂所必需。同样的原生质体分离，最近生长条件，和植株再生顺序，能应用所有柑桔种的珠心愈伤组织。但选择果胶酶源，可能影响原生质体成活率，视供试种而异。渗透稳定剂的反应常是关键；甜橙和酸橙原生质体对山梨醇不敏感，柠檬较敏感，柑桔很敏感。
至今，只有珠心愈伤组织原生质体完全了一种原生质体系统。Barger等(1981)报道了柑桔子叶、幼苗叶和成熟叶原生质体释放系统，其中只有子叶原生质体进行少数几次细胞分裂。
(二)培养程序
1．愈伤组织和胚形成
(1)取开花后约4周(每个栽培品种有其最适期，需经试验测定)幼果浸入1%亚氯酸钠10-15min，无菌蒸馏水淋洗3次。
(2)从消毒幼果中无菌取胚珠。每5cm培养皿接种约20个胚珠。MT基础培养基+0．15M蔗糖，500mg／l ME和1%琼脂，石腊膜封边。
(3)培养皿培养在26±1℃，16h暗淡光，14-12周后开始出现珠心愈伤组织。
(4)最初三次继代，用相同培养基(MT+ME)，然后转入MT(不加ME)，温光条件同。
(5)只有柠檬愈伤组织，当胚开始出现于培养的胚珠中时，将带胚珠转入MT+ME+2．3μM2，4-D，直到形成珠心愈伤组织，然后转入(4)中。
(6)为了保持愈伤组织，每4-5周继代一次。
2．胚形成、发育和植株再生
(1)愈伤组织继代在胚性发生培养基上，以促进胚胎发生(胚性发生培养基是MT+0．055M半乳糖代替0．15M蔗糖)。
(2)为了增大胚，将胚转入MT悬浮培养基，含有0．055M半乳糖，0．03mM GA3，和500mg／1MS，5周。
(3)悬浮物中的胚转入10cm培养皿，含有MT+0．06M蔗糖，0．03mM GA3和500mg／lME，5周。
(4)子叶胚继代在试管中，含有15ml MT十0．15M蔗糖0．1mM ADE，0．003mM GA3和0．7%琼脂，约5-7周。使芽进一步发育和生根。
(5)为了改进根系，再生植株转入试管，放在滤纸桥上，含培养液MT无机盐和0．06M蔗糖。
(6)根系发育良好植株，移栽Jiffy钵(7号)，放入密闭塑料袋内，保持高湿度。
(7)再生植株移置温室25±1℃，无菌混合钵土中。最初7-10天保持高湿度，逐步去盖复。
注：1-6步培养在26±1℃，16h光照。
3．离体筛选
(1)从愈伤组织筛选
①选择生长最好培养体为起点。取40mg外植体鲜重继代在选择剂的边际浓度上(重复10次)。
②5周后，选取生长最好培养体作为选择细胞系的起点。每系继代10次重复。
③每隔5周进行轮回选择，10次。
④基于生长或胚胎发生选取最好系，培养在选择剂较高浓度上。
⑤选耐性系进行稳定性测验(不加选择剂3次继代)。
⑥在选择剂的选定浓度上再培养。
⑦采用上节3-7步促进供试抗性或耐性系的胚胎发生和植株再生。
⑧测验过的抗(或耐)和对照系植株。
⑨抗性类型的无性繁殖。
(2)从悬浮细胞筛选
①取外植体(称重250mg)继代，放入装有25mlTM培养基的100ml欧氏三角瓶。放在旋转振荡器上，100转／分钟，25±1℃，15h光照。
②生长3周后，放在Whatman1号滤纸上真空过滤，收集细胞，供测定鲜重用。
③培养液中选择，每隔3周一次，至少继代10次，含有选择剂。
④取最好系测验稳定性，在不加选择剂中生长3次继代。
⑤再悬浮在选定选择剂浓度中。
⑥进行上节7-9步。
(3)原生质体分离和培养
①用珠心愈伤组织，每2-3周继代在MT上。
②取约0．5克愈伤组织放入培养皿，装有10ml软化培养基过夜，26±1℃。软化培养基组成：0．3%果胶酶或软化酶(R-10)，0．2%纤维素酶，溶于0．3M蔗糖，0．4M甘露糖醇和
MT大元素。过滤消毒(0．2μm)，备用。
③用网孔50和30μm顺序过滤分离原生质体。
④滤过物收集离心管中，加MT+0．3M蔗糖和0．3M甘露糖醇培养液，离心100×g5分钟，3次。
⑤原生质体以最后密度105细胞／ml悬浮在培养液中，MT加0．6%琼脂，植板在5cm培养皿的4ml水溶液中，石腊膜封边。
⑥培养在连续暗淡色下，26±1℃。
⑦胚培养和植株再生，见前节3-7步(再生程序节)。
4．茎和叶愈伤组织和植株再生
(1)从离体生长的四季桔幼苗
①无菌条件取出种子，去种壳。
②每粒种子放在装有改进MS+蔗糖146mM(下同)，肌醇0．55，烟酰胺4×10-3，盐酸吡哆醇3×10-3，盐酸硫胺素3×10-4，甘氨酸0．026，ME500mg／l和琼脂1%。放入生长箱16／8h光／暗，27°／21℃。
③6周后，幼苗长10-15cm，在子叶与第一叶间切取茎切段长0．5cm，纵切以促进愈伤组织形成。每培养试管接种3个外植体，装有MS+ME500mg／l，BA4．4×10-4，NAA5．4×10-4，琼脂1%，按2节条件进行培养。
(2)从柚子和甜橙离体生长的幼苗
①从人工培养生长的幼苗取小段茎或叶，接种在改进MS上(mM：NH4NO318．75，KNO314．85，CaCl2 2．72；KH2PO4 1．1，MgSO4·7H2O 1．46，盐酸硫胺素0．03，盐酸吡哆醇0．012，烟酸0．02，叶酸2．2×10-4，核黄素2．6×10-4，生物素4×10-4，抗坏血酸0．03，蔗糖146．0，琼脂7%，附加KIN 1．16μM，NAA 13．44μM和2，4-D 1．13μM)，培养在3000lux荧光下，14h光，26℃。
②保持愈伤组织用相同改进的MS，NAA减至2．26×103。
③从茎或叶愈伤组织诱导芽形成，用改进MS+BA 1．1μM，NAA 0．5μM和ME500mg／l。
④愈伤组织再生芽培养在改进MS+NAA 2．7μM或NAA和IBA(每种1．23μM)，以诱导生根。
(三)展望
因为珠心胚原发生、异质性和幼年期长，柑桔育种采用重组和选择受限制。很大部分改进的栽培品种来源于芽突变。诱变剂处理芽木或种子的常用程序，由于双倍体选择和形成嵌合体而导致突变的消失。轮回芽木选择需地大有困难。为此，着眼于利用细胞培养体诱导突变体。柑桔珠心愈伤组织具备人工培养突变体选择的许多性质。胚胎发生和二倍体细胞数能长期保持。珠心胚表现母性表型。一旦取得有益变异体，易于克隆繁殖。至今，珠心愈伤组织的选系和选择的细胞系和胚，Shamouli甜橙和酸橙耐NaCl，Shamouti甜橙耐2，4-D，Villafrance柠檬的一个细胞系耐Phoma fracheiphila产生的毒素。
原生质体诱变，尤其是原生质体融合产生体细胞杂交，存在着柑桔改良的可能性。柑桔属与其有关属间杂交，由于不亲和性，杂种种子发芽差，和杂种无生存力，而有障碍。再者，许多柑桔属杂交，由于亲本近于100%无配子生殖，而不能进行。8个柑桔种和栽培品种取得珠心愈伤组织的原生质体，并测定了营养需要的差异性。柑桔属有关种具有耐逆和病重要基因，可供改进砧木之用。
Hidaka等(1978)用柑桔重要砧木枳(Poncirus trifoliata)花药产生植株取得成功。从花药产生单倍体对遗传研究和诱变有重要性。改进芽培养方法对保持和交换柑桔种质很重要。多胚种子亲本的有性杂种和在组织培养中继续生长有助于育种，尤其是对有价值的杂交是如此。
已成功地取得了单胚发生栽培品种(宽皮桔)离体培养珠心植株。但是单胚发生的Cle-mentine宽皮桔珠心再生植株表现表型变异。再者，由于柑桔人工培养茎尖嫁接的发展，取得保型的较可靠方法，一般从已建成克隆尤其是单胚发生栽培品种取得无病毒材料是有用的。Navarro(1981)综述了这种技术的最近发展，和柑桔茎尖(分生组织)嫁接的应用。建成的柑桔无性系和不用珠心种子取得无病毒材料有巨大实用重要性。
【参考文献】：
〔1〕Arora，I．K．and R．N．Singh 1978 Growth hormones and in vitro callus formation of papaya．Sci．Hortic．8∶357-381．
〔2〕DeBruijne，E．，E．DeLanghe，and R．van Rijck 1974 Action of hormones and embryoid formation in callus cultures of Carica papaya．Int．Symp。Fytofarm．Fytiat。26∶637-645．
〔3〕Litz，R。E，and R．A．Conover 1978 In vitro propagation of papaya．Hortscience13∶241-242．
〔4〕Litz，R。E。1981 In vitro polyembryony in Carica papaya L。ovules．Z．pflanzen-physiol．104∶285-288．
〔5〕Yiu，S．an．d S．I．Liaw 1977 Plant regeneration from shoot tips and callus of papaya。In vitro 13∶564-567．〔6〕Krul，W．R．and J．Myerson 1980 In vitro propagation of grape．In∶Proc．Conf．on Nursery Production of Fruit Plants through Tissue Culture．Applications and Feasibility(R．Zimmerman，ed．)pp．35-43，USDA Sci．and Education Adm-inistrotion，Agric．Res．Results，ARR-NE-11，Beltsville，Margland．
〔7〕Lai，P．C．and H．T。I，1980 Studies on tissue culture of grape(Vitis viniferaL．)：Influence of environmental factors on the growth and differentiat ion of gra pe callus．J．Agric．Res．China，29(2)∶157-165．
〔8〕Meredith，C．P．1981 Genetic engineering-The outlook for grapes，Wine Inves-tor 5∶1——4。
〔9〕Mowbray，G．H．1981 Clone me around again，Willie．Virginia Farm Vine-to-Wine letter 1∶4-5．
〔10〕Olmo，H．P．1976 Grapes．In∶Evolution of Crop Plants(N．W．Simmonds，ed．)pp。294——298，Acad．Press，New York．
〔11〕Hadaka，T。，Y．Yarnada and T．Shichijo 1979 In vitro differentiation of haploid plants by anther culture in Poncirus trifoliata(L．)Raf．Jpn． J．Breed．29∶248-254．
〔12〕Maheshwari，P．and N．S．Rangaswamy 1958 Polyembryony and in vitro Culture of embrvos of Citrus and mangifera．Zndian J．Hortic。15∶275-282．
〔13〕Navarro，L。，C．N．Roistacher and T．murashige 1975 Improvement of shoot-tip grafting in vilro for vitus free clones．J．Am。Soc．Hortic．Sci．100∶475-479．
〔14〕Spiegel-Roy，P．and J．Kochba 1980 Embryogenes is in Citrus tissue cultures．In Advances in Biochemical Engineering(A Fi echt er，ed)Vol。16，pp．27-48， Springer Verlag，Berlin，Heidelberg．
〔15〕Vardi，A．1982 Protoplast derived plants from different Citrus Species and cultivars．Proc．I ntern．Soc．Citicultune．(1981)1∶149-152．