核果
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第602页（22429字）
核果(Prunus spp。)包括许多种木本植物，有乔木和灌木400种以上。分布于全世界。有些种是食用果实和坚果，有些供观赏，有些做根砧木。经济上最有价值的是：桃，泽李和李，甜樱桃和酸樱桃和扁桃。
许多核果难于用插枝繁殖(生根困难)，一般采用嫁接。有些根砧木是幼苗，有些是克隆。每种核果类型都有它适合的根砧木。Cummins(1979)报道了大量适于樱桃的根砧木的种。嫁接的接穗(栽培品种)可预测其抗(耐)性，抗病性，和其它生长特性。但常受根砧木供应的限制。微繁殖或人工培养繁殖可大大地提高繁殖率。
(一)研究进展
Boxus(1978)指出可用许多途径取得大量植株(表24-3)。理论上最有效方法，是从愈伤组织直接产生胚胎发生。由此可在连续培养中短期内取得成千植株。但是在木本果树中只有柑桔属珠心愈伤组织能以诱导成功。
表24-3 李属组织培养概观
a．外植体源：A=花药，Ax=继代侧芽，C=愈伤组织，Em=胚，Fr=果实，L=叶，R=根，S=茎，Se=种子，St=茎尖。
b，反应：Ad=形成不定芽(茎叶)，Ax=侧芽发育，C=愈伤组织，G=正常生长，R=根。
c．维生素：bio=生物素，Cap=泛酸钙，Fo=叶酸，gly=甘氨酸，myo=肌醇，nia=烟酸，paba=氨基苯甲酸，pyr=毗哆醇，ribo=核黄素，thia=硫胺素，
d．生长调节剂浓度mg／l，除非另有规定。
e．糖：G=葡萄糖，S=蔗糖。
f．其它：As=抗坏血酸，CH=水解酪蛋白，CW=椰乳，cyst=异亮氨酸，glut=谷酰胺，myo=肌醇，PG=间苯三酚，PVP=聚乙烯吡咯烷酮，
第二种方法，直接促进植株器官如叶和茎形成不定芽。但不是任何果树都能有效地产生芽器官发生。如杏胚胎发生小片形成不定芽，同样酸樱桃花药亦形成不定芽，但稳定性较低。最近报道能促进三个李属种受伤根产生不定芽。
第三种方法，刺激侧芽生长。采用芽培养，促进休眠侧芽的伸展，每个芽能发育成单个芽，转而成完整植株。理想上，此法的繁殖效率不如第一、二法，但可适用于许多果树，被广泛采用，每年产生成百万倍植株。
为了找出适用于特种核果种或栽培品种的繁殖系统，首要的要找出培养基，供给离体植株部位所需的食料、营养、维生素，荷尔蒙等。
1．培养基和培养基组分常用培养基有三种基本类型：高盐(MS)、中盐(Nitsch和Nitsch，1969)和低盐(White，1963)培养基。核果培养现常用改进的MS。Kester等(1977)杏愈伤组织在MS完全浓度时，生长差，在White培养基较好。MS稀释
，愈伤组织生长较好。Caponetti等(1971)发现黑樱桃愈伤组织培养体，在Wetmore和Rier(1963)培养基(低盐)上生长最好，在MS上表现差。说明培养基盐类总浓度是最重要因素。
根发育是荷尔蒙和盐浓度的函数。许多生根培养基用低盐培养基(例如White)。Quoirin等(1977)测试李属4个种的根发育，
强度MS好。Feucht和Nachit(1978)发现
强度MS大量元素促进根发育。Riffaud和Cornus(1981)观察到P．avium在20%盐浓度时生根。Durstem(1981)同种试验结果，则以
生根。Lane(1979)取得相同结果。另一方面，Hammerschlag(1982)发现红叶素芽培养在
上，有时矮缩和坏死。
Boxus，Quoirin和同事们培养许多蔷薇科植物(包括许多Prunus种和草莓)在他们设计的基础基上的繁殖，取得部分成功。其最大特点是微量元素水平很高(与大多数组织培养基相比)；采用了百倍于Heller(1953)推荐浓度。Quoirin和Lepoivre(1977)仔细研究了这种现象，发现锰限制着李属芽尖生长和测芽形成。这证明了锰较高用量的效果。
另一常见现象是失绿或离体培养下失去绿色素。学者认为由于缺铁所致，曾用不同方式在培养基中加铁。有些情况下仍有失绿。Seirlis等(1979)把李属培养物培养在附加4倍的培养基中，经几次继代无效。他们提出失绿可能与培养基中的高细胞分裂有关。
(1)碳水化合物碳水化合物在组织培养基中有二种主要功能，(a)供组织能源，和(b)保持培养基内渗透潜势。最普遍采用的是蔗糖。在大多数培养基用量20一30g／l，有些要高很多。Zwagerman和Zilis(1979)发现“Thunclercloud”(一种观赏李)在改进的MS+BA4．4μM+NAA0．54μM上增殖好，但蔗糖水平增至0．175M时，幼芽增殖不再要NAA，芽产生紫红色(这个栽培品种的特征)。
Coffin等(1976)蔷薇科常用山梨糖醇。许多蔷薇科植物愈伤组织在附加蔗糖或山梨糖醇的培养基上生长良好。有些植物在山梨糖醇上比蔗糖的生长为好(例如，Relience桃)。
(2)氮化合物 曾用氨基酸或水解酪蛋白(CH)培养几个李属种，但是否对生长是绝对必要还不清楚。
(3)维生素 蔷薇科植物培养基的维生素曾用过二种极端：Skirvin和Chu(1979)采用最复杂维生素混合液，叫“Staba”维生素；Linsmaier和Skoog(1965)培养基只用盐酸硫胺素。其余最适维生素数界于其间。很清楚有些维生素抑制生长；例如Miller等(1982)发现从他们培养基(培养Nemagard桃根砧木)除去Staba维生素，生根好。并发现核黄素是抑制生根的专化维生素。全部学者都报道硫胺素，烟酰胺和吡哆醇有重要性。
(4)琼脂与液体培养基 琼脂用量差异相当大。MS用10g／l(1%)，但许多学者把它降低到8g／l或更低。高浓度琼脂的渗透潜势，伴着降低营养和有机物质，是降低琼脂浓度的普遍理由。
许多学者采用振荡或滚筒培养和或Heller(1949)滤纸桥以支撑培养在液体培养液中的材料。
Lane(1979)认为用琼脂培养基培养P．cistena生根不好，由此他用了Heller桥。Kohlenbach和Wernicke(1978)指出琼脂对某些植物培养体有毒害。
Hammerschlag(1982)报道了Sunhigh和Compact Redhaven桃接穗，用培养液培养时，旋转7rpm，增殖增高20-30倍，而琼脂培养基上仅增殖8倍。可惜，茎尖生长在连续转动培养体中，变成水浸状，容易折断，为此将培养物培养在旋转床上仅2-3周，或生民在Heller桥上。她提出抑制作用部分是由于琼脂毒性所致。还认为液体培养基有利于芽全表面吸收荷尔蒙和营养物质，有助于打破顶端优势。还便于鉴别细菌或真菌污染，后者会出现云雾状。反之，Tabachnik和Kester(1977)旋转液体培养和滤纸桥培养，都会降低杏和杏-桃芽生长。
(5)荷尔蒙 测验曾用于核果树的各种培养基和荷尔蒙组合指出：(1)只要有生长素和细胞分裂素的几乎任何培养基的培养体都产生愈伤组织(除非是已驯化的愈伤组织)。(2)芽增殖(不定芽和侧芽)一般需要生长素和细胞分裂素，但继代中，只要细胞分裂素即可。(3)相对高生长素促进生根，细胞分裂素常抑制生根。
Ghugale等(1971)研究几种生长素对桑组织生根影响。激动素(4．6μM)与四种生长素各别配合，结果是(a)KIN+NAA20%生根；(b)KIN+IAA有50%；(c)KIN+IBA有70%；和(d)KIN+IPA有80%生根。
Dunsten(1981)发现F12／1甜樱桃根根台木在高浓度NAA(8μM)培养基上易生根。但是，这些芽产生愈伤组织和形成根，它们融集变粗。常移栽土中后死亡。另一方面，他们发现最后一次继代中，在有相对高浓度BA(4．96μM)加较低浓度NAA(4．0μM)培养基中，4天内生根较好。当根长0．25-0．5英寸时，即可移栽土中。如果继代前根过长，土中存活率会降低。
促进生根的诸荷尔蒙，常混合加入培养基，但有人把幼芽先用生长素处理，然后移进无生长素培养基。Popov等(1976)将‘Shubinka’酸樱桃芽浸在IBA(0．24mM)溶液中18小时，改进了生根能力。Riffaud和Cornu(1981)用速蘸IBA(5．0μM)或培养基附加IBA(5．0μM)，培养甜樱桃取得相同的生根成效。
除Miller和Skoog(1953)的经典荷尔蒙关系外，Nemeth(1979)发现当P．myrobalan和甜樱桃的芽生长在相对高光强(约2000lx)下时，BA能刺激生根。偶尔甜樱桃芽在根出现前，在其茎部产生棕色木质化组织。
一般认为愈伤组织形成与根和芽增殖有颉颃关系。为此力求降低产生愈伤组织。众所周知采用愈伤组织培养增高细胞变异率的可能性为了保证克隆稳定性和芽和根增殖，愈伤组织应减到最低。
(6)生根辅因子 Nekrosova1964报道樱桃的‘叶提取液’，促进了培养物生根。Feucht和同事们考虑到李属含有大量酚类物质，提出设想某些这类化合物可能起着生根辅因子作用。在一系列试验中发现这些化合物是初级绿原酸，其浓度差异是亲本植株生长率的函数(即矮树浓度低，旺盛型则高)。终于鉴定了这些物质，并作为附加物加入培养基。后来发现芸香苷和／或二羟二苯檞皮酮能促进李属种(eucerasus section)愈伤组织生长。他们提出假说离体培养中的绿原酸作用，在于抑制IAA氧化酶，由此这些未解体的IAA能以刺激愈伤组织格外生长。
有些学者用核果属其它种进行类同观察。Mosella等(1980)用芸香苷或檞皮酮改进了生根，用根皮苷改进了植株质量和生根率。Negueroles和Jones(1979)在加间苯三酚(根皮苷的裂解产物)培养基上，桃根母株生根100%，不加的为60%。也使每个培养体平均生根数增多(加7．2，不加1．7)。绿原酸也有助于红叶李光培下生根。另一方面，有些学者报道过这些酚类物质绝对无益，Jordan等(1980)报道了实质上绿原酸抑制欧洲甜樱桃生根。
2．组织培养的外植体 植株的任何部位都能建成组织培养体，经验指出有些部位较为相宜。Murashige(1977)提出要比较研究植物不同部位的培养适应性。
(1)组织年龄 Murashige(1977)认为核果树(与其它木本树相同)以幼龄外植体反应最好。例如，杏胚愈伤组织能分化形成根、芽和完整植株，但成熟植株愈伤组织则不能。
幼年组织虽有利用作组织培养，其有用性可能有限制。其理甚明。学者们要找出适于组织培养其它组织。Sommer等(1962)发现桃中胚层组织带有维管束组织，在人工培养下形成最好愈伤组织。Hadtrich(1977)从叶身，中脉和叶柄以及节间切段和根都能产生愈伤组织，但只叶身的愈伤组织有根分化。从叶组织直接产生的根，有向地性，有根毛，而经由愈伤组织产生的根，未见上述特征。Nozeran和Bancilon(1972)提出根和花器官近端，常相对幼龄的，可供选作组织培养的材料。
如果找不到幼龄组织，其它组织未能证实其适合性，有可能采用重度截枝(从树基切断)重现的幼芽(用荷尔蒙处理或嫁接)。可是，在可能条件下，应从比较不同年龄的器官中，找出最适外植体。
虽然成熟组织在人工培养其表象不如幼年的，在人工培养下外植体缓慢地(或很快)回复其幼龄性。Nozeran和Bancilon(1972)用葡萄注意到这种回复。连续继代后，茎尖变得更幼龄和生长较好。Boxus和Quoirin(1972)用李属得到相同结果。
(2)外植体-荷尔蒙互作 不同器官对培养基成分反应不同。Mehra和Mehra(1974)首次用李属愈伤组织产生不定芽取得成功。用扁桃种子在离体培养下发芽，然后从无菌幼苗切取各种器官建成培养体植株不同部位的分化和最适于产生愈伤组织所需化学试剂不同。例如，根和下胚轴组织产生愈伤组织需基础培养基+NAA11．0μM+CW%，而叶、茎、子叶、胚和茎尖则需基础培养基+NAA27．0μM+CH1g／l。经2-3继代后，愈伤组织在培养基+NAA11．0μM+CN10%生长良好。当用附加细胞分裂素的培养基，叶、子叶和胚的继代的愈伤组织形成植株。其产量很低(分别为8、5和2%)。全部再生植株是二倍体，可是，细胞形状、大小和细胞内含物，视培养基成分而有极大差异。
Nitsch(1965)用离体培养诱导桃果组织的生长。他发现中果皮和内果皮组织都能培养，但各自对培养基组分的反应不同。n-萘乙酸酰胺对中果皮有强烈生长调节作用，但对内果皮的影响中等。另一方面，KIN强烈影响内果皮，但对中果皮几无影响。Feucht(1974)观察到类似结果，他发现皮层薄壁细胞受ABA的影响，大于形成层组织。还发现用各种荷尔蒙浓度可区别地建成特定组织的愈伤组织系：高浓度NAA(5．4μM)刺激皮层增殖，而低浓度(5．4μM)对刺激形成层细胞有作用。
(3)制备培养的外植体 常用组织消毒法，是将植株部位浸在已知浓度次氯酸钠(常用稀释的商品漂白粉如Clorox)。组织表面消毒，通常用10%漂白粉，与表面活化剂(例如，0．1%TritonX-100吐温20)混合尤佳。Fisher和Tsai(1978)报道椰子培养体生长，受常用水平的漂白粉溶液所抑制。只有把其浓度降到0．5-1．5%才能回复良好生长。多毛组织有时用真空系统，以保证消毒充分。由于漂白粉对植物细胞有毒害，必需用无菌蒸馏水淋洗2-3次，保证漂白粉稀释。
许多学者发现一次漂白粉处理，不足以保证培养体无污染。作者在桃培养中，常用正常消毒程序，包括用10%Clorox+0．1%Triton X-100浸10min，继之用无菌蒸馏水淋洗5min，2次。此法对大多数植物有效。但用于桃常仍有100%污染。为此改进了处理方法：首先将桃尖放入25%Clorox+0．1%Triton X-100 10min，继而用水淋洗5min，2次，然后，将茎尖浸入70%乙醇5min，再用水淋洗5min2次。采用这种方法，污染率降低50%，杀伤率仅10%。Maroti和Levi(1977)报道最好先用45%乙醇淋洗3min，再用5-10%漂白粉溶液处理10分钟，无菌水淋洗3次。
Nekrosova(1964)报道用0．1%HgCl2消毒最适时间结果：杏2min；桃茎芽6min；侧芽20-25min；酸樱桃6min；P．cerasusvar，besseyi6min；森林海棠8min；柠檬茎尖4min，侧芽35-40min；茶藨子18min。
Johnes等(1977)提出了复杂消毒程序如下：
第一阶段消毒
①组织蘸0．01-0．1%表面活化剂20s。
②组织浸入0．14%可给态氯溶液1min。
③组织用无菌蒸馏水淋洗3次。
④组织移至无荷尔蒙和维生素培养基上24h。
第二阶段消毒
①从培养基取出组织，蘸0．01-0．1%表面活化剂20s。
②组织浸入0．1%benomyl(灭菌剂)15min。
③组织浸入0．42-0．50%可给态氯30一40min。
④用无菌蒸馏水淋洗组织3次。
⑤组织转移到新鲜培养基上。
Hammerschlag(1980，1982)培养桃组织研究把真菌和细菌污染降到最低的可测方法。她发现未处理对照100%污染，而用Skirvin和Chu(1977)法污染率70%。经一系列试验后，最后设计了下列方法，采用这种方法，污染率降低到3%。
①冬季从亲本树上取休眠但充分春化的接穗木，在实验室浸入水中。
②当开始出芽时，切取。
③除去每个芽的外部叶。
④将芽大小从0．5cm切短至0．2cm。
⑤将芽浸入10%clorox+0．01%吐温20，15-20min。
⑥将芽放入100ppm青霉素-链霉素溶液5min。
⑦用无菌蒸馏水淋洗芽3次。
⑧将幼芽转移到液体培养基的滤纸桥上，1-2周。
⑨芽正常生长。
木本植物除有上述表易侵染外，内部也有之。James和Thurbon(1978)即使经培养几周的组织，‘M9′苹果根砧木能出现细菌污染，在幼外植体基部附近渗出晕圈物质。经病理学家鉴定包括至少5种细菌类型。因此，常用添加细菌的培养基筛选培养体，每月更新一次。方法是将培养体转移到细菌培养基上，生长在25℃3天。淘汰污染。James和Thurbon报道经5轮筛选，有一个培养体生存，但第6轮时，出现了污染，在测试的300个培养体中有25%污染。“筛选的”培养体每个月增殖7倍，而“未筛选的”芽每个月增殖约2-3倍。Jones和Hopgood(1979)将欧亚野李和甜樱桃，培养在添加细菌培养基上有规律地筛选。培养基组成是YE3g／l+细菌胨5g／l+琼脂12g／l，pH6．8-7．0。Lane(1979)培养P．cistenia茎尖在附加CH的培养基上，以促进细菌和真菌生长。将存活的培养体转移到加BA不加CH的同样培养基上。
Hammerschlag(1982)筛选生长在液体培养的红叶李。受污染后变成乳浊色。Skirvin和Larson(1978)用Difco抗生素片控制草莓培养体污染取得成功。可惜某些抗生素也能抑制草莓培养物的生长。Skirvin用商品抗生素卡那霉素减低细菌污染。Wettenbach和Buko-vac(1980)在培养基中加benomyl 0．34mM，樱桃培养物受真菌污染大大减低。
Cheng(1978)报道了果树培养的稍有不同的消毒程序。用Alconox水溶液洗外植体，然后用Clorox6-20%+Alconox0．2%消毒。接种在不加荷尔蒙的基础培养基上一周，使培养物产生“适应”；再转移到正常培养基。Rosati等(1980)也用适应培养基，不加硫胺素、荷尔蒙和肌醇。李在此培养基培养6周，然后转移到完全培养基。
3．分化
(1)芽 木本植物愈伤组织分化器官和完整植株能力很有限。也有少数成功报道。Mehra和Mehra(1974)从杏仁胚愈伤组织再生完整植株。Seirlis等(1979)和Gayne等(1980)从酸樱桃花药愈伤组织和根愈伤组织再生植株。Druart(1980)用几种李属种根形成植株。其法：(a)从增殖培养基取侧芽移至生根培养基，(b)产生根生长到长2-4厘米，(c)从培养基取出完整植株，放回增殖培养基，(d)20-30天后，在继代时受损伤的根上可见愈伤组织，和(e)愈伤组织增殖，转移到新鲜再生培养基，诱导芽形成。
迄今供试李属种的茎尖培养增殖，无特殊问题。种间在增殖率上有差异，有栽培品种增殖较快。Lane(1979)报道P．cistena培养体，在人工培养下开始生长前，有2个月滞留期。最后，每3-4周内，增殖率为35倍。采用此法，Spirea bumalda在3-4周内增殖率高达300-400倍。
(2)根 人工培养茎尖，虽已成为核果树增殖的常规方法，但这些芽不易生根。许多李属种和栽培品种活体生根难，人工培养也不一定能增高。Faucht和Dausend(1976)研究甜樱桃(难生根种)组织培养。发现离体培养茎切段生根率与活体反应成比例。也发现这些种的愈伤组织，在适宜培养基上易于生根。
Cheng(1978)用2，4-D加入再生培养基预处理、pixy′和、St．JulienX′李根砧木的芽，使之在不加生长素的培养基上生根。Seirlis等(1979)在培养基不加BA，就足以在不同李根砧木上促进发根。
Mosella和同事们提出一整列促进、GF305′桃生根的程序：
①诱导阶段：暗培24℃5天，培养基附加IAA2．9μM或NAA2．7μM。
②启动阶段：把芽转移到加芸香苷或槲皮酮的培养基上，再暗培3-4周。
③根伸长阶段：培养体转到加GA0．3μM培养基上，暗培1周，然后在光强约1000lx下生长2-3周。
④植株移栽土中。
许多学者发现细胞分裂素，尤其是BA，将刺激侧芽发育，但高浓度下，芽伸长被抑制(Chaix，1981；Kester等，1977)。较大芽常比小芽生根较好，诱导生根前可能有必要使芽伸长。Popov等(1976)报道、Shubinka′欧洲酸樱桃芽，如果长5mm以上，生根最好(约60%)，短芽生根率较低(10-20%)。Quoirin等(1974)发现P．accolade短芽在根培养基上经常死亡，而较大芽易于生根，易移栽入土。Howard和Oehl(1981)报道欧亚野李小和高株在离体培养下都生根良好，但只有较高株能在田间存活和生长好。还说移栽植株大小基本上是生根培养基上时间长短的函数。在培养基上培养3，6或9周的培养体，其生存率分别与50，80和90%。
(3)嫁接 木本植物生根仍有困难，嫁接是另一方法。其理由：(a)嫁接超越珠心和有性幼苗的幼年阶段；(b)几乎所有核果栽培品种传统采用嫁接繁殖，当一种栽培品种嫁接在特定根砧本上，生产者能预测需加防治的病原菌，植株生长习性，和与根砧木相关连的锻炼；和(c)生长在组织培养中的茎尖和分生组织能施以热处理，以产生无病毒植株。
嫁接方法可采用Navarro等(1975)的柑桔嫁接法。采用离体培养发芽的或温室生长的幼苗做根砧木。Alskief和Gautheret(1977)提出嫁接步骤：用、GF305′桃种子，消毒，浸无菌水中24小时，移至基础培养基上，放在3℃90天，种子发生分层贮放效果。然后将种子移到实验室27℃，暗培，发芽。约8-10天后，幼根出现，即可供嫁接用。嫁接的新植株移至含糖高的培养基上。他们为了种子发芽用蔗糖0．15M培养基，嫁接芽生长用蔗糖0．22M。芽可在人工培养下进行嫁接或活体上嫁接。
嫁接成功率常不高，似乎与下列因素有关：经验，砧木和接穗条件和年龄，环境和一年中的时期。Mosella等(1979)提出当用、培养基B′(含有根皮苷和BA或ZEA)预处理桃接穗产生健全植株，这种健全接穗极易嫁接(这些植株也将易于生根)。另一因子可能与嫁接不亲和性有关。Martinez等(1979，1981)报道了各种桃与杏，桃与樱桃李间不亲和性，在人工培养下很快看出，而在活体上嫁接和生长的，要多年才能见到。Fujii和Nito(1972)也发现过嫁接不亲和性现象。
(4)移栽土中 试管苗在高湿(相对湿度100%)和弱光下生长，长得弱嫩，一旦移出，常受干燥大气和强光冲击，萎蔫致死。Dunstan(1981)报道将带根植株移至2英寸土钵中，放在薄雾中7-l0天，成活率85%。薄雾有助于苗的锻炼，增高在土中成活机会。许多学者把生根培养体移植无菌土中或
石中。用玻璃瓶、塑料袋或塑料蓬遮盖保湿遮光。经10一21天后，许多植株能经受自然大气条件。
除成活问题外，组织培养繁殖植株(尤其是自主生根的)，在冲击下，其旺势常不如常规繁殖的。Howard和Oehl(1981)指出、Pixy′李根砧木微繁殖变化很大。盆栽二个或更长季节后，许多植株产生弱丛生状，而不是最适用于嫁接的强单茎植株。由于这些问题，他们提出了一种体系，能以保证成活高和一致性。这个体系概要如下：
①植前驯化：将芽放在Jones和Hopgood培养基(1979)上6周。密闭试管移至温室正常光照下1周(光周期16h)。
②钵栽：将长2cm芽移出试管。钵栽(8cm)，装有泥炭7份：沙3份：壤土1份。
③离乳：将钵放在清洁聚乙烯蓬高湿下10天，逐步移去遮蓬。然后放在沙架上20℃。植株生长在16h光照，光强500W钨灯。
④成长：将钵移放在加满石砾的架上，光强400W汞灯。温度不低于15℃。
⑤GA处理：用GA0．58μM+吐温20喷植株，直至滴水。
采用这些步骤，可保证植株生长良好。
Jones和Hopwood(1979)提出将根砧木芽移至外界环境的较简便方法。从增殖培养基上取出幼芽，移至根培养基，经约3周后，培养试管和带根植株移放遮荫温室10天。将植株移入8cm装有“堆肥”钵中。生长在湿繁殖箱内14天，然后放进温室，供正常生长。
学者们装钵用土壤混合物各有不同。Stone(1963)报道石竹芽在1∶1∶1泥炭∶沙∶壤土加盖一层泥炭或沙的生长好。这种混合物比珍珠岩或蛭石混合物为好。Resati等(1980)将日本李植株移进1∶1∶1泥炭∶珍珠岩∶沙中。Popov等(1978)无论1∶1∶1土∶泥炭∶沙或3∶1泥炭∶沙都能满足、Shubinka′酸樱桃的需要。Dunstan(1981)用3∶4∶1泥炭∶珍珠岩∶沙混合物。
Dunstan(1981)报道移栽苹果和桃的156000芽入土，成功率85%。其指导原则是：(a)生长在温室平台上的幼株，浇水时避免加力冲苗，以防苗弯歪，(b)幼株易感立枯病，应视需要喷杀菌剂，和(c)春移大田时，应先锻炼植株；夏移时，在移进大田前，先放在有50%遮荫下一个短时间，以防叶灼伤。
4．环境因子
(1)季节 大家知道一年中从大田植株取的组织与培养条件的处置应有不同。Monsion和Dunez(1971)认为在法国采取P．mariana茎尖和芽为外植体的最适时期是5月25日和8月14日，可保证形成茎叶和根。
Skirvin(1981)报道早春采收桃接穗，生长在实验室花瓶中，是外植体好供源，其污染低。随着季节前进，外界温度上升，污染率相应增多。
因此，组织培养外植体应选取贮放在无乙烯室内冰箱的接穗木。将带有休眠芽枝放进水中，让其生长。Quoirin等(1975)指出贮放在4℃(12月-4月)的P．accolade枝，在人工培养下产生反常丛生茎尖。
(2)光 环境条件对梅属植物生根作用还不清楚。Mosella等(1980)认为诱导生根很复杂，为了产生完整植株，需要若干不同阶段。以桃为例：(a)诱导——培养体暗培24℃，加IAA 2．9μM或NAA 2．7μM；(b)启动——培养体暗培3-4周，加芸香苷或槲皮酮；(c)伸长——植株移至加GA0．29μM培养基，暗培1周，再移至16h光照2000lx2-3周；和(d)带根植株移入土中。Feucht和Dausend(1976)发现了暗培对欧洲甜樱桃和樱桃茎(不带芽)切段生根有重要性。Hammerschlag(1982)当将红叶李侧芽培养加IAA和加或不加GA培养基上，暗培2周，全部生根。在1／2强度MS培养基上光培加IAA或IAA+绿原酸，生根百分分别为30和100%。显然绿原酸有助于保护IAA不受光降解影响(可能是抑制IAA氧化酶)。Hammerschlag详细讨论了这种观察结果。
Nemeth(1979)报道了光对甜樱桃和P．myrobalan生根重要性。加BA培养基和连续光照高光强生根最好。2000，1000和800lx的生根百分各为46．7，36．5和24．6。Jordan等(1980)用甜樱桃观察到光照下生根95%。虽尚不能得出决定性结论，显然学者应比较研究光和暗培下生根效果。
(3)温度 只部分地研究了温度对梅属组织培养的影响。Hammerschlag(1981)桃茎尖生存率在21-24℃的比26-30℃的为好。Riffaud和Cornu(1981)P．avium培养体在弱光(200lx)、连续19-20℃生根100%，而在25℃日和19℃夜，光强2500和200lx下，分别为33和67%。Hammerschlag(1981)红叶李培养体26℃比21℃的发根较快。
Chaix(1981)发现了曾储存在2℃6个月的甜樱桃培养物，繁殖率高。事实上，培养物储存时间愈长，增殖愈快。Howard和Oehl(1981)发现如果把欧亚野李带根培养体贮存在0℃4个月，能使之在田间生长更一致。为了防止干枯和失绿，贮存前可把培养体密封，盖以聚乙烯膜，以防尘污，在培养架上方25厘米处，加装100W钨光灯。
5．应用
(1)离体培养下嫁接亲和性 当亲和性的接穗嫁接到砧木上，完成嫁接结合的最早征状是形成愈伤组织。Fujii和Nito(1972)研究来自葡萄、桃、栗、柿、梨和苹果全部组合的愈伤组织的嫁接亲和性。发现了不同科植物都能在培养基上生长在一起(例如，柿、栗、苹果与葡萄)。有些组合互列生长但从不接着，有的相互抑制。Martinez等(1979)讨论了桃与樱桃李和桃与杏嫁接不亲和性的发展。众所周知的一种嫁接不亲和性是或由接穗或砧木产生的氰化物。Heuser(1972)在加氰化物的培养基上，研究三种矮生李属根砧木的嫁接不亲和性，比较它们的生长率。
Feucht(1975)培养李属种的矮、半矮和正常株茎切段。愈伤组织鲜重与母株生长旺势无关。所以，培养在相同荷尔蒙浓度培养基上的生长旺的和矮株的生长潜势相同。但是，外植体开始细胞分裂与李属种生长旺势有关；生长愈旺，细胞分裂停滞期愈短。旺的甜樱桃与矮P．fruticosa间相差约2天。
(2)病害发生和抗性 曾用愈伤组织培养体研究李属病害发生。Caporali和Weltzien(1974)用Taphrina deformans(Berk．)Tul．侵染桃愈伤组织培养体，研究它的发生。Hammerschlag(1981)提出一种检测法，将桃叶肉细胞(不一定是愈伤组织)暴露在Xant-hamonas pruni的毒性培养物的过滤物和缬氨霉素中，用mergoganine540染色，荧光测定膜潜势。她发现易感栽培品种Sun high与毒性培养物在一起表现明显膜变化，与无毒性培养物只发生轻度改变。当细胞受X．pelargonii(非病原菌的)只注意到短暂修饰。而抗性品种Compact Redhaven即使与毒性培养物共培养改变也轻。
果实和坚果栽培品种中，存在着病毒手册中列出的“类似病毒病的遗传病害”某些与繁殖有关的病害。栽培品种中偶或可见，嫁接后不加传给健全植株。其中之一是扁桃的“非侵染的芽衰”(BF)。仲夏较高温下表现为茎芽坏死。且只出现于一个克隆内的个体上，似乎是受高温所引起，一旦出现不得回复。如果接穗木能在早期筛选BF状态，就可从繁殖母株中除去诱生木。Kester等(1977)能将杏仁愈伤组织生长在1／2强度MS上。发现从BF木产生的愈伤组织，25℃生长好，但35℃将受抑制。反之，正常木愈伤组织以35℃生长最好。采用这种途径，可对杏仁木筛选BF。
(3)发育研究 由于人工培养下器官发育比活体上的为慢，组织培养是深入发育研究的有效途径。Wittenbach和Bukovac(1980)利用人工培养技术培养不同发育时期的樱桃果实。发现取发育、时期Ⅱ′前的果实培养不见生长，而取、时期Ⅲ′果实鲜重增加和成熟，表现为形成色素和软化。
(4)产生无病毒植株 病毒病是核果树很严重问题。通过联合采用热处理和茎尖培养继以嫁接到无病砧木上可能消除。Friland(1980)讨论了一般技术和学说。Mosella等(1980)进行了测验。用2种病毒(李瘟病毒和坏死环斑病毒)侵染一些桃株，取茎尖，微嫁接在幼苗砧木上，观察病毒感染。50%以上培养体证明无接种的病毒。
在任何情况下，已有的无病毒核果树应用人工培养技术保存在种质贮存库，以保证未来之用。
(5)花药培养 曾在甜樱桃，杏，桃和樱桃等花药培养产生了单倍体细胞。花药和花粉粒培养再生能力有限，曾有成功报道。Jordan(1975)和Jordan和Feucht(1977)从P．pandora与甜樱桃分别产生了突破外壁的外细胞花粉粒；此外，有些花药分化生根。Seirlis等(1979)用樱桃花药培养再生植株，这是迄今仅有的报道。全部植株都是二倍体染色体数(非单倍体)。
(6)繁殖 李属的组织培养目的在于找出繁殖特定栽培品种和种的快、省方法。Pie-rik(1975)评述了乔木和灌木繁殖的组织培养，结论是利用组织培养繁殖有4项原则：(a)用已有方法进行活体营养繁殖效率过低或无收益，(b)活体营养繁殖不可能，(c)植物育种家要求快速增殖新株型，或(d)有必要产生无病(病毒、细菌、真菌、线虫等)植物材料。
Faust和Fogle(1980)预期高和超高密度果树日益发展。这类果树选用密植、机械整修和相对短命的植物类型，种植密度高达每公顷4000株。组织培养具有提供省高质量树的潜势。
果树组织培养商品生产以欧洲规模最大。建立了合作实验室(意大利)繁殖果树和蔬菜。用小制罐瓶生长桃根砧木，设有控温、光室，每个培养室可放20000瓶。并用瓶继代，然后移栽土中。也有用纸钵繁殖桃砧木的。移栽温室后6个月出售。法国Orleans INRA森林研究中心用组织培养繁殖甜樱桃供造林用。并找出离体培养和活体繁殖的几种有用方法。
(7)胚培养 最早采用组织培养之一是使未成熟胚在人工培养下生长成熟。Tukey(1933)初次从事核果树组织培养，用甜樱桃未成熟败育胚培养在他自己设计的极简单培养基上。这项技术以后为许多核果育种家所发展。胚培养的价值集中于拯救正常成熟前败育的胚。Abou-zeid(1973)讨论了李属胚培养的培养基组成Ivanicka和Pectova(1980)报道在培养基上生长和生根胚培养体，但有些植株根系差，移植后死亡。将弱芽从胚培养基移至芽增殖培养基。再将增殖芽移至生根培养基，根发育好。胚成活率有相当大的增高。
(8)离体培养无性系稳定性 与离体培养植株组织培养相关连的变异体可分类如下：(a)未分化愈伤组织内物理的和形态的变化，(b)形态建成变异性，(c)分化再生植株的变化，和(d)染色体变化。Skirvin(1977，1978，1981)详细讨论了这个领域。
Mehra和Mehla(1974)在悬浮培养体中发现许多不同细胞类型：很长，高度液泡化，螺旋形生长习性，有些含油滴。只有少数发生组织化。愈伤组织培养体染色体计数指出，在2或更多次继代后，出现2n，3n和4n细胞。Legeida等(1976)在甜樱桃培养体中染色体数有相当差异。但在亲本克隆间的不同倍数性水平细胞的百分数有不同。
曾再生、生根和土中生长的全部核果植物，在栽培品种内很少差异。Boxus和Quoirin(1977)发现在西班牙栽种11年以上的许多李种和栽培品种中无变异。Jones和Hopgood(1979)用70个Pixy欧亚野李根砧木其中有23个长成丛生状，而不是亲本的正常直立生长。Howard和Oehl(1981)研究发现这种变异不是由于突变，是由于未经寒冷过程。无论用低温处理幼株或喷GA，可克服这种丛生状态。
(9)无性繁殖栽培品种 许多园艺栽培品种常用插枝繁殖，由于种子繁殖不能保持亲本性状。但用剪枝与嫁接繁殖苹果(或任何李属种)，产生的个体与亲本几无不同。许多无性繁殖作物组织培养产生植株，除少数外，都相似但不相等同。差异常是次要的，但有利于品种改进。曾见典型变化是叶形、果色、抗病性和生长习性。
(二)培养程序
1．建立李属细胞培养物
(1)冬季大田取休眠接穗，捆束，放在无乙烯冷藏，约0一2℃贮存。
(2)预备制备细胞培养体时，取出部分储存木，在水中切除末梢(以利于木质部吸水)，浸在水中放置室温温室或实验室内。如果室内很干，可盖以塑料袋以防干燥。
(3)至少隔天换水一次，防止微生物。为了防止木质部为真菌菌丝塞住，有必要经常切除木端。
(4)当芽开始萌发和叶展开时，可取出作为外植体源。这些芽要极少污染。
(5)用幼叶、叶柄或茎组织启动愈伤组织培养体。为了茎尖培养，将芽切短成0．5-1．0cm，采用Hammerschlag(1982)法(见上节讨论)。
(6)组织用Hammerschlag(1982)技术消毒(见上述)。
(7)外植体接种在适当培养基上。为了控制污染，培养基中可加杀菌剂(benomyl)和、或抗生物质。
2．保持
(1)每隔3-6周应将培养体继代一次，视需要而定。曾试用在培养物开始转灰白时继代到新鲜培养基上。
(2)每隔2-3个月，用James和Thurton(1978)技术筛选培养体的细菌污染，加以淘汰。
3．分化
(1)从侧芽生长进行芽增殖 采用最适于供试种和栽培品种的培养基。
(2)从愈伤组织产生芽分化 Druart(1980)法(见前)可适于其它种。
(3)芽上生根 变化很大无普遍适用技术。应采用多种体系，找出最适方案。
4．移栽入土，温室和大田生长
(1)带根芽应移入小钵和生长在薄雾中。最好采用Dunsten(1981)法(见前)。
(2)如果再生植株长得矮缩或丛生，则在钵栽前，应用低温处理，用Howard和Oehl(1981)法为宜。
(三)展望
核果树组织培养主要目的是找出有效繁殖方法。现已成为离体培养商品繁殖生产。此外，有助于基础科学家用以研究基因稳定性，分化和基因型-环境互作的手段。其将来发展也将涉及繁殖，可望用于不同领域如作物改良。其可能性是：
1．采用Druart(1980)体系从某些核果树产生不定芽植株，供科学家用以研究培养基组成、荷尔蒙、环境因子的复杂互作，外植体源对酶诱导、分化和代谢影响。继而利用真实愈伤组织培养体从单细胞产生完整植株。
2．变异性是保持一个克隆的遗传稳定性中的一个问题，要找出减少或消除这种变异性。
3．组织培养中自发的和诱发的变异性都对改进特定栽培品种有价值。通过筛选克隆内变异和选择改进的基因型而取得。Hammerschlag(1981)体系可在人工培养下桃细胞对Xanthomonas prunui的不同敏感性，可用于选择抗特定毒素的单细胞。由此而再生植株。
4．利用花药培养产生单倍体植株，无疑地将变得更为重要。 Seirlis等(1979)已能从樱桃花药取得再生，其他学者从花药培养产生单倍体细胞。
5．一些核果树有性不育，由于它们的倍数性水平(三倍体性)，不能产生成活子代。应有可能分离出染色体数加倍的植株。Gayne等(1980)正在进行樱桃根砧木Colt研究。
6．现已用分生组织培养产生无病毒植株。应有可能找出方法以贮存这些芽，以便建立种质库，保存种和栽培品种。
7．繁殖某些难繁殖的或难生根植物，将继续是组织培养中主要问题。就某些作物言，组织培养将成为主要繁殖方法。
总之，自Tukey1933年经典胚培养研究以来，核果组织培养取得了巨大发展。整个领域现已扩展到，已具备了极少污染、繁殖和根培养，和刺激愈伤组织产生植株的体系。任何核果作物能在人工培养生长只是时间问题了。一旦建成这些方法，科学家们应能以利用这些木本植物培养研究分化、遗传稳定性和植物-培养基与植物一环境互作。
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