核磁共振波谱学

出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第275页（3921字）

核磁共振波谱学是研究放入静磁场Bo中的磁性核吸收相应频率的射频场B₁能量状况的谱学方法，属射频波谱学。

由于具有极高分辨率(0．1Hz)，其共振频率能准确反映分子中各核微观环境的微小差异。并且，自旋－自旋偶合常数与核Overhauser效应(NOE)分别揭示核间成键状态及空间关系。对同一分子还可通过分子中的不同核种进行多核核磁共振研究。核磁共振波谱学已渗入化学、生物、物理、医学等广泛领域中，成为研究分子的结构和动力学过程的最有效手段之一。

1946年布洛赫(F．Bloch)与珀塞尔(E．M．Purcell)领导的两个小组同时发现了核磁共振现象。1950年前后相继发现了化学位移和自旋－自旋偶合作用。

表征核外电子分布状态的化学位移和表示核间通过成键电子相互作用的自旋－自旋偶合常数是核磁共振波谱的两个基本结构参数。据此50年代已确立了核磁共振氢谱在有机化学结构和动力学研究中的独特地位。

60年代初发展起来的双共振技术，又为确定谱线归属，提高灵敏度提供了有效途径。

核磁共振波谱对微小结构差异的高度灵敏与检测灵敏度的低下形成了显明的对照。除不少磁性核为天然丰度低的同位素外，灵敏度低的根本原因在于其观测频率在所有谱学方法中最低。因此，核磁共振波谱的发展，一直围绕着提高灵敏度这一主题开展。

前后采用不断提高Bo、极化传递、双共振等技术。而1966年厄恩斯特(R．R．Ernst)与安德森(W．A．Anderson)在谱学上率先成功地进行了付里叶变换波谱实验。他们采用强而短的射频脉冲实现了多频道激发。然后检测其响应一自由感应衰减信号，经付里叶变换获得了通常的频谱。

脉冲傅立叶变换技术与宽带去偶技术相结合，将核磁共振波谱的灵敏度提高了一两个数量级，是一次革命性的飞跃。借此一些自然界中重要的¹³C、¹⁵N等稀弱核的观测，成为常规测试。70年代核磁共振碳谱，取得了辉煌的成功。与此同时，电子学、计算机技术的迅速发展，尤其是超导高磁场磁体方面的进展，大大改善了核磁共振波谱检测灵敏度，对中小分子的氢谱，其样品所需量由早期的几十毫克降低到几百微克。

脉冲傅立叶变换核磁共振问世以后，早期人们的注意力集中在利用其多频道波谱节省时间的优点，提高灵敏度。

不久，人们很快发现该方法的另一优点一对信息的可加工性，根据需要对复杂信息进行剪辑。1971年吉尼尔(J．Jeener)在南斯拉夫举行的夏季讨论会上提出了二维核磁共振的想法。待体系达到热平衡，激发脉冲产生信号后(预备期)，不是立即观测，而是令其发展一段时间(演化期)，后传递给另一核(混合期)进行检测(检测期)。

实验中以一定增量逐步增加演化时间进行一系列观测，获得两个独立时间变量t₁和t₂的函数f(t₁，t₂)，对其进行两次傅立叶变换便得到两个独立频率的函数F(ω₁，ω₂)，即二维波谱。1974年厄恩斯特小组首次成功地进行了二维实验一二维J谱实验。

他们利用t1和t2期间的哈密顿作用的不同，将化学位移与J偶合分离到两个频率轴上，显示二维谱将变量范围由一个轴推延到一个平面带来的好处。后经厄恩斯特和弗里曼(R．Freeman)等小组的不懈努力，二维核磁共振波谱结出了丰硕的果实。70年代中期以后，人们的注意力逐步转向更重要的二维波谱——二维相关谱。1976年厄恩斯特小组发表了二维波谱理论描述的经典文章。之后的5年期间，相继发展了化学位移相关谱，二维NOE谱，多量子波谱等。相关谱中t₁期间的某核的磁化(或相干)，在混合期中传给与其作用的另一核，颇似接力赛中队员将接力棒传给自己的队友。它的魅力在于在一个实验中将相互作用核之间的所有偶合网络一并勾画出来。通过¹H^－1H之间键合作用建立起氢偶合网络的同核化学位移相关谱COSY、通过¹³C^-1H之间J偶合作用建立碳氢偶合网络的异核化学位移相关谱C－H COSY、经二次或多次传递建立次近邻或次次近邻网络的接力COSY，建立质子整个偶合网络的TOCSY等，如雨后春笋般争相涌现。

一维FT核磁共振中不能直接检测的多量子跃迁，在二维谱中可间接予以观测。1980年前后，弗里曼小组巧妙利用双量子相干发展了¹³C^－13C COSY谱，据此首次可以通过谱学信息直接勾画出分子中碳的骨架。

化学位移相关谱的发展，改变了人们传统的谱分析方法，不再是一味追求谱线位置的精确估算，而是通过核间联系把握分子结构。1979年厄恩斯特小组提出了另一类相关谱－化学交换与二维NOE谱NOESY。NOESY谱是靠交叉驰豫建立的相关谱，因此它提供的是有关核间空间距离的信息。键合作用和空间距离信息的结合，使很多与构象有关的难题迎刃而解。二维相关谱不仅成功地应用于天然化合物等中小分子的结构研究中，而且在生物大分子结构研究中亦获得极大的成功。80年代初，伍斯里胥(K．Wuthrich)小组发展了由NOESY谱得到的有关距离范围的约束以及由J偶合值得到的有关扭转角约束条件下，经距离几何法计算，确定溶液中生物分子三维结构的方法。

1985年首次用二维NMR方法独立确定小球蛋白－牛精液蛋白酶阻止剂的完整三维结构，之后几年内已确定几十个分子量在10000u以内的小蛋白质在溶液中的三维结构。继单晶X射线衍射法之后，二维核磁共振波谱成为崭新的研究分子空间结构的有力工具。

它既不需要培养单晶样品，又可在接近于生理状态下测定生物大分子的三级结构，使其具有更大的吸引力。

当研究10000分子量以上的分子时，遇到了两个主要困难，即谱线严重重迭和谱线变宽。鉴于此1987年前后发展了三维核磁共振波谱，它是由两个二维实验适当合并而成。由于波谱变量由二维的平面扩展为三维空间，在二维谱中拥挤重迭的峰进一步散开，便于分析。

人们发现同核三维相关谱中，交叉峰数目增加，不易分析，而且当大分子的谱线线宽超过同核J偶合值时，其同核三维化学位移相关谱中，有关峰消失，限制了其应用。与此相反，异核J偶合值较大，其交峰数目与二维波谱大致相同，引起了人们的广泛关注。为了克服稀核灵敏度低的困难，采用了¹³C、¹⁵N等核高度浓缩的样品。1989年前后用浓缩样品成功地进行了异核三维、四维核磁共振实验，用¹⁵N化学位移差异分离NH氢谱以及用¹³C化学位移的差异分离α氢氢谱的重迭，进而确定了分子量在20000以下的小蛋白质的水溶液结构。

化学、生物、医学等领域对复杂对象的结构与性能关系以及分子间作用与运动的探索，必将进一步推动核磁共振波谱学的发展。超高场磁体的研究仍会继续，近几年内17．5T磁体的750MHz核磁共振商品谱仪即将投入市场。

多维核磁共振波谱的主要困难，在于所用时间长，数据量大。除了配置大存贮、快速的数据系统外，如何提高实验效率将成为活跃的课题。替代相位循环而采用脉冲梯度场，将大大缩短实验时间。

减少间接检测的时间域上的数据点是热门话题，研究更佳的选择脉冲，进行选择性多维实验以及发展有效的线性预测等方法推延数据看来有望。

由核磁共振数据推测大分子三维结构的软件系统，仍需进一步研究，尤其是包括全弛豫矩阵分析在内的NOE数据分析以及约束动力学分析等有效优化方法的开拓，至关重要。

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【参考文献】：

1 BlochF.et al.Phys Rev,1946,69:127

2 Purcell EM.et al.Phys Rev,1946,69:37-38

3 Ernst R R.Anderson W. Rev Sci Instr,1966,37:93～102

4 Bax A. Two-Dimensional Naclear Magnetic Resonance in Ligllids. Reidel,Dordr-echt:1982

5 Ernst R R,Bodenhausen CWokaun A. Principles of Nuclear Magnetic Reson - ance in One and Two Dimensions, Oxford:Clarendon Press, 1987.

6 Wuthrich K. NMR of Proteins and Nucleic Acids. New York;Wiley,1986.

7 裘祖文，裴奉奎．核磁共振波谱．北京：科学出版社，1989

8 Griesinger G,et al. J Magn,Reson,1989s84:14～63

9 Clore G M,Gronenborn A M. NMR Spectroscopy to Protein Structure Determination,Progr NMR Spectrosc,1991,23:43 ～92

(中国科学院长春应用化学研究所博士生导师裴奉奎研究员撰)