三链DNA

出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第844页（5672字）

1957年，Davis、Felsenfield和Rich等就提出三链核酸结构的概念，他们以两条poly(U)和一条poly(A)链合成出一种三链物质。

1966年，Miller和Sobell提出第3股RNA可连接到操纵基因上作为阻遏物的设想，但由于同年证实了乳糖阻遏物是一种蛋白质，此设想破灭了。1975年，加州大学L．E．Perlgur等人研究体外三链DNA的形成过程，按标准DNA制备步骤，从牛脾脏中以MgCl₂代替氯化钠－柠檬酸钠缓冲液(SSC)制备出牛脾DNA的镁盐(MgDNA)；天然牛脾NaDNA经热变性可制得相应的单链的NaDNA，根据260nm处双链MgDNA与变性单链NaDNA结合时的减色效应，可推知三链DNA的形成，其浮力密度为1．726g／cm³。

A．J．Raae等(1978年)研究在T4聚核苷酸连接酶催化作用下三链核酸的连接形成过程。这些核酸确实能够形成三链结构，在紫外吸收曲线上可以看到有三链核酸的转折点，低温下混合物吸收曲线的形状表明存在三链化合物和双链化合物，主要产物还是1∶2的三链结构，实验还发现在三链DNA中T4连接酶仍可催化dT₁₀的连接，并且反应速率同形成双链的、三链的DNA的速率大致相同。研究者们还观察了多胺对反应的影响，发现低浓度的多肽、腐胺、尸胺及亚精胺(＜10^－3mol／L)对T4酶在双链载体上的催化连接反应有激活作用，而当浓度较高时，则又呈明显的抑制作用。因此，低浓度的多胺能提高三链结构的连接反应速率。

J．S．Lee等(1979年)研究(Py)_n·(Pu)_nDNA(Py为嘧啶，Pu为嘌呤)在H+浓度大于10^－6mol／L情况下的结构形式与变化，有4条证据表明这种化合物是由一个三链化合物及一个具有二级结构的多聚d(Pu)组成。

过去有人认为：Py·Pu DNA结构作用的特殊性在于Py·Pu DNA能与RNA形成三链化合物的高度特异性。

例如，d(TC)_u·d(GA)_u只与r(UC)相互作用形成三链化合物d(TC)_n·d(GA)_n·r(UC⁺)_n，两条嘧啶链是反平行的．RNA链沿着DNA的大沟缠绕，以Hoogsteen碱基对方式配对，这就需要一个质子化的胸腺嘧啶，因此，这类结构在pH值较低时有利。A．G．Letai等(1988年)以琼脂连接的均聚核苷酸亲和柱为手段，研究了形成三链核酸化合物的特异性，即均聚DNA、共聚DNA和RNA碱基互补配对的特异性。

1987年，S．M．Mirkin等从准天然途径中发现DNA的三螺旋结构，以此为转机，对三链DNA研究的势头在国外兴盛起来。Mirkin等在酸性溶液的质粒中发现DNA的一种三链结构，称为H－DNA(绞链DNA)，规则的均聚嘌呤核苷酸－均聚嘧啶核苷酸片段(dC－dA)_n·(dT－dC)_n和(dG)_n·(dC)_n在低pH(4．3)条件下，经过超螺旋诱导，发生结构转变，生成新的DNA构型，即H构型。

研究者提出，H构型可以在任何镜象重复的均聚嘌呤核苷酸－均聚嘧啶核苷酸中产生(核苷酸序列具有H回文形式)，为了验证此假设，采用一系列裁剪过的质粒片段，均含有AAGGGAGAAXGGGGTATAGGGGYAAGAGG－GAA这样的内插序列，其中X、Y为A或G，通过二维凝胶电泳进行分析，结果表明，当X=Y=G，或X=Y=A时(具有H回文形式)，插入序列很容易转变为H构型；而在X=A、Y=G或X=G、Y=A两种情况下(非回文形式)，构型转变要困难得多，几乎不可能。研究者认为，H构型是S1核酸酶超敏性的结构基础。

1990年底，白春礼等在用扫描隧道显微镜(STM)研究噬菌体λ DNA－Hind Ⅲ的变异结构时，发现一种新的三链DNA结构，称为三链辫状DNA。

实验方法为：将这种DNA的水溶液加热到其T_m点之上的100℃，保持约15min左右，然后快速降温到0℃，将此经过处理的稀溶液滴到新鲜剥离的裂解石墨表面，待溶剂蒸发后，在室温条件下用STM直接进行观察，从获得的图象上看到由3条DNA链形成的发辫状三链结构，并且还观察到由双螺旋与结构片段与三链辫状结构片段的衔接结构，以及右手双螺旋与左手双螺旋结构片断的衔接结构。

三链也同样是通过氢键作用形成，也有它的专一性。三链的基本结构有两种，一种是嘧啶－嘌呤－嘧啶，如TAT．CGC⁺等；第2种是由嘌呤－嘌呤－嘧啶组成，如AAT，GGC等。三螺旋的形成，所受的限制要比双螺旋多。首先，中间的碱基一定得是嘌呤；其次，双螺旋的形成只需4个核苷酸以上即可，但三螺旋据推测至少要8个以上，所以，三链结构需要特殊条件才可产生。

对于三链结构的初步研究资料表明，第3条链一般是沿着双螺旋的大沟缠绕上去。

由于A型核酸的大沟较B型的大，所以三螺旋结构应当是A构型，但对三链辫状结构则不然，由于3条DNA单链在空间构型上都处于“均等”的位置，每条链的作用基本相同。

D．S．Pilth等(1990年)对(dA)₁₀·2(dt)三螺旋进行结构分析，在中性pH的MgCl₂溶液中诱发出三螺旋(dA)₁₀·2(dT)₁₀并使之稳定，进行圆二色谱(CD)及核磁共振谱(N－MR)研究，核Overhause效应(NOE)对未氘代和C₈－H－氘代的(dA)₁₀·2(dT)₁₀三链的测量结果表明，在溶液中亚胺上的质子和腺嘌呤C₈－H质子及芳香质子C₂－H之间有偶极接触，因此，在MgCl₂溶液稳定的三链结构中，胸腺嘧啶亚胺上的质子N₂－H既包含W－C又含H－oogsteen碱基对。对NMR研究也证实三链形式中存在W－C及Hoogsteen碱基对，对八聚体的及十一聚体的三链的研究资料表明，包含有TAT及CGC⁺三链碱基，在低pH及／或MgCl₂中较稳定；UV及CD实验资料研究均证实1∶2的摩尔比形成三链的(dA)₁₀·2(dT)₁₀。

P．Rajagopal等研究溶液中DNA三螺旋的形成及结构，主要运用一维质子及二维质子NMR谱及NOE测量方法，虽然嘧啶－嘌呤－嘧啶三螺旋的基本结构曾根据纤维衍射研究资料作出过预测，然而目前的NMR研究资料提供了关于溶液中存在此类结构的第1个直接证据。

第1组使用两种八聚体，d(G－A)₄，及d(T－C)₄，分析表明，在H⁺浓度10^－6mol／L下，等量的寡聚物形成B型双螺旋结构，而在高H+浓度下，样品包括双链的和三链的混合物，形成的主要三链有4个T－A－T及3个C－G－G⁺三链碱基对，由第2条寡聚嘧啶与具有最后未配对胞苷的寡聚嘌呤平行键合。关于三链的螺旋构型，NMR数据表明嘧啶链具有A构型。第2组使用七聚链及十一聚链，由相当随机的嘌呤及嘧啶系列组成，每一组的序列都作了设计，以使寡聚嘌呤能够以一种反平行方式补偿一条寡聚嘧呤链；另一条则为平行方式，NMR谱证明在酸性pH(5．0)条件下，TAT及CGC⁺三链碱基能够形成，当pH值提高至中性，三螺旋又解离为双链组分和单链组分，三链的总体构型是A构型，与纤维衍射研究结果相似。

高分辨NMR方法在监测不同的三链碱基异常氢链键合作用，被认为是最有用的方法，甚至可扩展至四链结构或八链结构，然而由于这种方法限制在相对小分子量化合物(＜50核苷酸)，其它类似方法如X射线晶体学、凝胶电泳及酶探针等，可用于研究极大分子量合物体系如H－DNA等。

白礼春、叶坚和龚立三等用分辨率极高的扫描隧道显微镜测定这种结构，成功地观察到三链DNA的存在。

S．Arnott等用X射线法测定三链poly(dT)·poly(dA)·poly(dT)的结构，与前人描述过的RNA三链化合物作了比较，发现poly(dT)·poly(dA)·poly(dT)在构型上类似，poly(V)·poly(A)·poly(U)及poly(D·poly(A)·poly(1)。三链化合物的精细结构远比双链复杂，因为三条多聚核苷酸链彼此各不相同。J．Griffith等人(1990年)研究了蛋白质Res A催化形成的三链结合体的结构，在一个线型dsDNA和环形DNA配对过程中观察到无蛋白的较长三链区域，所有3条链有十分规则的结构，好像典型的正常双螺旋DNA，然而在上千个碱基长度上却包含着3条紧密相连的DNA链。H．Htun等(1989年)研究了三链H－DNA的形成和拓扑学结构重复的共聚物(dT－dC)_n·(dAdG)。

序列(TC·AG)_n可假定为一种H－DNA结构，由三链区域和单链区域组成，是形成H－DNA的一种模型：H－DNA的形成始于共聚物内部的一个小的变性包，其中的双链DNA在一边轻微旋转、折叠回去，以生成第1个三链碱基对，这种成核过程建立了一种非平衡的H－DNA构型。假定为任一DNA分子捕捉到一条处于不能进行自由内部转变的亚稳态构型的DNA分子，结果，当单链多聚嘧啶在给体区域由于逐步的变性而松弛时，受体区域缠绕单链分子，缠绕与变性导致其余DNA分子负超螺旋的松弛。

可以预测，DNA超螺旋的水平决定着(dT－dC)_n的那一半将要变成给体第3链。3′及5′一半的多聚嘧啶链都可以用作HDNA的给体链(分别称为H－y3DNA及H－y5DNA)，H－y3及Hy5构型是等价的，而形成H－y3比H－y5更有利于松弛负超螺旋，说明在拓扑学上和能量上是不等价的，两类构型可以在非内部转变、亚稳态形式中共存。

关于三链核酸结构的量子生物学计算，F．Gago等(1989年)使用计算机图形学及分子力学计算方法研究三链化合物的构型，提出在一个超螺旋的DNA分子中寡聚核苷酸(链₃)与两个配对的(链1，2)链合作用中，链2会采取一种左旋构型，而链1和链3以正常的W－CB构型配对，分子模型是在SGIRIS 3120工作站中利用互相作用的分子图形程序HYD－RA来构筑的。S．Arnott等人通过计算机化的原子关联步骤提出若干种三链化合物的细节性模型，并且保留标准键长、键角及糖环构型，研究者使用计算机程序通过这种信息来预测可能的分子结构，基本方法是采用原子关联最小二乘法(LALS)。

分析结果表明，第3条链占据着A构型多聚核苷酸双链的大沟，并且与两条W－C链之一通过Hoogs-teen碱基对相互作用。

三链结构的生物学作用目前仍知之甚少。有人曾提出，双链DNA与单链RNA的相互作用对基因表达可能有调控的功能。Anott等指出，A型螺旋可能是转录过程中所需要的，这种机理假定，DNA中或发生B构型向A构型的转变，在富含dA、dT的DNA结构中尤为可能。

三链核酸对不同的DNA、RNA聚合酶可能起抑制作用。

S．A．Strobel等人研究酵母染色体上通过寡聚核苷酸定位形成三螺旋DNA实现特殊位置上裂解的过程，结合有EDTA·Fe的寡聚核苷酸可以通过与双链DNA特异结合形成三螺旋，并且在长度大于12个bp的裂解位上产生双链的裂解，为了证实寡聚核苷酸定位的三螺旋形成是大的DNA基因组特异性裂解的可靠化学途径，一条带有EDTA·Fe(在5′及3′端)的寡聚核苷酸被定位连接在SE CE染色体Ⅲ(340kb)的一个20bp序列上，观察到有着确切尺寸和位置的双链裂解产物，显示出在14×10⁸bpDNA中寡聚核苷酸的连接和裂解靶位，三链的碱基结合形式有TAT，C⁺GC，GAT等。

长度为15～20bp的EDTA、Fe寡聚核苷酸在长如λ噬菌体(48．5kb)的基因组内的靶位上产生特殊序列双链破裂的效率从5%～25%。嘧啶寡聚核苷酸在双链DNA上形成区域三链的序列特异性依赖于pH、温度及有机共溶剂等条件，如在低pH、低温或加入乙醇的情况下，观察到寡聚核苷酸结合在有意义的靶位序列上，但并非完美匹配，因为酵母基因组的完全序列还不清楚，在SE－CE染色体Ⅲ上的次级结合位的位置和数目还不能事先作出预测；由于寡聚核苷酸定位的三链核酸的形成有可能成为DNA识别的一个一般性方法，故该结果对于染色体的遗传图的测定、基因的分离及DNA序列的确定具有重要的意义。

对三链DNA的生物学意义只能进行一些预测，但作为转录过程中DNA－RNA三链形成的一个可能模型还是有价值的。有人认为这样的三链形成要求DNA的大沟加宽。也有人提出，一个短的三链DNA片段是DNA复制过程中的中间体。M．Cooney等(1988年)根据在人体c－myc基因特殊位置上DNA与寡聚核苷酸的键合作用(在双链结合位上寡聚核苷酸形成共线型三链物)，提出三链态的形成(特殊位RNA与DNA双链的结合)可能是体内基因控制交替程序的基础。

据S．Hayes等发现，在λ噬菌体中，DNA复制的初始过程包含着小的RNA寡聚物分子，可以假定这个过程存在三链结构，RNA在通常是B构型2级结构的DNA中会充当诱导因子。三链DNA研究的热点将主要集中在两个方面：具有特异性裂解正常DNA分子的功能；在基因转录过程中起诱导、阻断等作用。

人们一旦在细胞水平上掌握这种功能后，就能够通过三链阻断转录机制治疗一些遗传性疾病和病毒性疾病，如爱滋病、乙型肝炎等，这是值得生物学和医学工作者去努力探索的课题。

(中国科学院化学研究所郭军、张平城、博士生导师白春礼研究员撰)