厌氧菌感染DNA探针诊断技术

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第121页（1694字）

1．材料

(1)地高辛标记脆弱类杆菌DNA探针试剂盒和待检菌株或标本。

(2)硝酸纤维滤膜(NCP膜)、塑料膜、移液器等。

2．检测方法

(1)菌液制备：待检菌液约为10⁶～10⁷CFU／ml，即10～100ngDNA较为合适。

(2)划线点样：在NCP滤膜上划出约1×1cm大小方格，用微量加样器取上述菌液点样，同时用生理盐水点两个空白对照。

(3)干烤：将点样NCP膜夹于双层滤纸中，置烤箱80℃，干烤5～10分钟备用。

(4)变形：将NCP膜置大平皿变形液(试剂盒内配有变形液，或自配0．6MNaOH，1．5MNaCl)，室温中处理10～15分钟，取出用滤纸吸干，再至中和液①和②中(中和液①：1．5MNaCl，1MTris，Cl，pH7．5；中和液②：0．6MNaCl，1．5MTris，Cl，pH7．5)，分别处理10～15分钟，取出夹于双层滤纸中，至80℃烤箱1．5～2小时，烤干后备用。

(5)预杂交：将上述处理的NCP滤膜装入塑料袋中，加入预杂交液1～3ml(或3～4ml／100cm²)，封袋，置42℃振摇4～6小时，开袋回收预杂交液。

振摇前先置100℃，变性10分钟，再置冰浴5分钟，再封袋振摇。

(6)杂交：直接在袋内加入杂交液1～3ml，封袋，42℃振摇过夜，然后回收杂交液(预杂交液及杂交液都在试剂盒中配有，回收的预杂交液和杂交液置－20℃冰箱中，可反复使用)。

(7)洗膜：剪开塑料袋，将NCP膜于平皿内，2×SSC液中室温振摇5分钟，取出置2×SSC／0．1%SDS溶液中67℃漂洗15分钟，又取出置0．2×SSC／0．1%SDS溶液中67℃，再漂洗15分钟。

(8)振摇：将NCP膜小心地移至塑料袋中，加Buffer Ⅱ封袋(2～3ml／100cm²)，42℃，振摇40分钟，再回收Buffer Ⅱ液(挤尽塑料袋中液体，－20℃贮存，可反复使用)。

(9)探针标记和洗膜：往塑料袋中加入Anti-Dig-Ap(1：5000in Buffer I)，封袋，室温中30～60分钟，再用Buffer I洗膜2次，每次5～10分钟，同时振摇。最后用Buffer Ⅲ洗膜1次，振摇5分钟。再回收Buffer Ⅲ液。

(10)显色：加入显色液NBT4．5μl／ml、BCIP3．5μl／ml和Buffer Ⅲ1ml封袋，避光置室温中4～12小时。

(11)中止反应：将NCP膜置清水中漂洗以中止反应，衬于滤纸上晾干、封袋，可长期保存。

(12)内标对照：每次杂交试验都设内标(阳性)对照。

3．结果观察和记录 阳性为紫色或蓝色斑；阴性为无色。

上述操作为地高辛标记的脆弱类杆菌全菌探针检测方法，操作过程中除了注意阳性和阴性对照试验外，还应注意不在点膜上的假阳性判读。上述方法敏感性为89%，特异性为91．7%，检测灵敏度为10⁴～10⁶CFu／ml细菌或10～100PgDNA。基本上能满足临床检验要求，但开发更敏感的克隆片段的基因探针仍然很有必要。