液相色谱分析
出处：按学科分类—工业技术 企业管理出版社《计量专业工程师手册》第647页（6291字）
1．简介
液相色谱法是以液体为流动相的色谱分析法，是分离高沸点、难挥发、热不稳定样品的有效手段。它利用物质的吸附热、分配系数、粘度、离子强度等物理和物理化学性质的差异，将混合物分离成单一组份，再利用物质的光学、热学、电学、电化学等性质进行检测，根据出峰时间、峰高或峰面积进行定性、定量测定。
液相色谱按分离原理分为吸附色谱、分配色谱、离子色谱和体积排斥色谱(或称凝胶渗透色谱)，按固定相的方式分为柱色谱、薄层色谱和纸色谱等，本节讨论的是柱色谱。
(1)液——固色谱
液——固色谱是以硅胶等吸附剂为柱填料，正已烷、异丙醇等溶剂或它们的混合液为流动相。进样后，样品在固定相和流动相间连续地吸附、脱附，达到平衡。由于物质在吸附剂上吸附能力的差别，造成它们在固定相上停留时间不同，吸附力强的在固定相上停留时间长，后从柱中流出，吸附力弱的在固定相上停留时间短，先从柱中流出，由此达到彼此分离。
液——固色谱的固定相是多孔、颗粒状固体吸附剂，通常分为极性和非极性两类。极性吸附剂包括无机氧化物，如硅胶、氧化铝、硅酸镁、分子筛等，非极性吸附剂最常见的是活性炭。吸附剂还有酸性、碱性之分，酸性吸附剂优先吸附碱性物质，而碱性吸附剂则优先吸附酸性物质。常用的商品吸附剂列于表12．11－6。
表12．11－6 常用的商品吸附剂
在高效液相色谱中，对流动相的基本要求是①与色谱柱不发生不可逆化学变化，②能溶解被分离的样品，③与使用的检测器匹配，④粘度尽可能小，以获得高柱效，⑤毒性小，易纯化，价格便宜。
在液——固色谱中选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性的流动相。溶剂的极性强度可用溶剂强度参数ε0表征，ε0表示单位面积吸附剂表面的溶剂吸附能。ε0越大，溶剂的极性越强。表12．11－7列出了以氧化铝为吸附剂时，某些溶剂的洗脱强度顺序。
表12．11－7 氧化铝上的洗脱序列
液——固色谱常用于分离极性不同的化合物，也能分离具有相同极性基团、但数量不同的样品。另外也能分离异构体，这主要是异构体有不同的空间排列方式，适应吸附剂表面状态的情况有差异，因而得到分离。
(2)液——液色谱
液——液色谱又称液——液分配色谱。在液——液色谱中，一个液相作为流动相，另一个被分散在载体上的液相做固定相。作为固定相的液相与流动相不相溶，它们之间有一个界面。固定液对被分离组份是很好的溶剂，流动相则是一种很差的溶剂。当被分离的样品进入色谱柱后，各组份按照它们各自的分配系数很快地在两相间达到分配平衡。这种分配平衡的总结果导致各组份在迁移速度上产生差异，从而实现分离。
在液一液色谱中，一般使用极性固定液，常用的有β·β一氧二丙腈，聚乙二醇等，用非极性溶剂(如正已烷、氯仿等)作流动相分离极性化合物，也有的在惰性载体上涂渍非极性固定液(如角鲨烷等)，用极性溶剂(甲醇一水，乙腈一水)作流动相，分离非极性或弱极性样品。这种方法也称反相色谱法。
液一液色谱不仅能分离官能团或官能团数不同的化合物，而且特别适合分离那些仅差一个碳数的同系物，通过选择一对适当的分配体系，液一液色谱几乎能分离分子量在2000以下的各类混合物。与液一固色谱相比，液一液色谱还具有稳定、重复、溶剂便宜等优点。
(3)键合相色谱
化学键合相色谱是采用以硅胶为载体，利用硅胶表面的硅醇基(－Si－OH)和有机分子成键而形成的各种性能的固定相的色谱。键合到载体上的有机基团主要有①疏水基团，如不同键长的烷烃(C8和C18)和苯基等；②极性基团，如丙氨基，氰乙基，醚和醇等；③离子交换基团，如作为阳离子交换基团的胺基，季胺盐，作为阳离子交换基团的磺酸等。
采用极性较小的键合固定相，如硅胶－C18H37硅胶一苯基等，用强极性溶剂为流动相，这种方法称为反相键合相色谱，它多用于分离多环芳烃等低极性化合物。若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可分离极性化合物，若采用水和无机盐的缓冲溶液为流动相，可分离一些容易离解的样品，如有机盐、有机碱、酚类等，克服了用正相色谱分离这些化合物时柱效低和易产生拖尾的缺点。
若硅胶表面键合的是极性有机基团，如CN、NH2等，则一般用于正相色谱，即用非极性或极性较小的溶剂并加入适量的极性溶剂作流动相，用于分离极性化合物和异构体等。
若以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如－SO3H，－CH3NH2等，就形成了离子键合相，用于分析离子型化合物。
键合相色谱的优点是可以通过改变流动相的组成和种类，有效地分离极性、非极性、离子型化合物，键合到载体上的基团不易流失，特别适合梯度洗脱。常用的键合固定相列于表12．11－8。
表12．11－8 常用化学键合固定相
(4)离子交换和离子对色谱
离子交换色谱和离子对色谱特别适合分离离子型和可离解的化合物，在这两种技术中，化学平衡对化合物的分配过程起主导作用。
离子交换色谱的柱填料是一种带有电荷官能团的固体基质，带有
等负电荷的称为阳离子交换剂，带有
等正电荷的称为阴离子交换剂。为保持交换剂的电中性，基质还存在带相同电荷但正、负号相反的离子(称反离子)。
在离子交换中，流动相中的被分析离子与反离子发生竞争吸附，离子交换反应的平衡常数越大，固定相对被分离离子的保留越强。在离子交换色谱中，通过控制流动相中反离子的浓度、离子强度、离子类型等，调整被分析组份的平衡常数K值，以获得较好的选择性和柱效。
常用的离子交换基质有三大类，即合成树脂(聚苯乙烯)，纤维素和硅胶，流动相常用水－乙醇混合溶剂，有时甚至全部采用有机溶剂。
离子对色谱法是将一种或数种与样品离子电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相中或固定相中，使之与样品离子结合成离子对，从而控制样品离子的保留值的色谱法，它是由离子对萃取技术发展起来的，离子对色谱分正相和反相两种，反相离子对色谱使用较普遍，一般反相离子对色谱使用十八烷基，苯基等键合固定相，用甲醇－水，乙晴－水等为流动相。在流动相中加入离子对试剂，对有机碱常用烷基磺酸盐作离子对试剂，对有机酸常用四丁基氢氧化铵等作离子对试剂。调节流动相的PH离子强度和有机溶剂的浓度，使各种类型化合物分离，也使离子型和非离子型化合物彼此分离。
离子对色谱法广泛地用于各种离子型化合物的分离，如药物、涂料中间体、表面活性剂等，被认为是分离离子型化合物的强有力武器。
2．液相色谱仪的主要特点及检定
目前使用的液相色谱仪称为高效液相色谱仪，它是相对经典色谱而言的，它在分离理论、方法上与经典方法有很大差别，设备材料方面有很大改进，分离速度及效率有较大提高，灵敏度、重复性和准度方面也有重大改善。
高效液相色谱仪一般分为四部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外，根据一些特殊要求，还配备一些附属装置，如梯度洗脱、自动进样和数据处理装置等。
液相色谱仪的结构示意图如图12．11－3，其工作过程是高压泵将贮液罐的溶剂经进样器送入色谱柱中，然后从检测器出口流出。当欲分离的样品从进样器注入后，流经进样器的流动相将其带入色谱柱进行分离，被分开的样品组份依次进入检测器，记录仪将检测器产生的信号记录下来，得到液相色谱谱图。如图12．11－4。
图12．11－3 高效液相色谱仪结构示意图
色谱柱：Zorbax-CN：流动相：含150mL／L异丙醇的正已烷；检测器：UV－254nm
1．异丁基甲基氧杂蒽；2．咖啡咽；3．氯霉素；4．皮质醇
图12．11－4 在键合固定相上分离药物
高压输液系统由储液槽、高压输液泵、过滤器、压力脉冲阻尼器等部分构成，核心部件是高压输液泵，它是高效液相色谱仪的心脏，有足够的输出压力，使流动相顺利通过颗粒很细、填装紧密的色谱柱，通常的压力范围为25～40MPa／cm2。输液泵的流量应恒定，流量精度在1～2%，流量在一定范围内可调，压力平稳，脉动小。
进样装置一般为六通阀，它能保证样品快速、准确、定量地进入色谱柱。六通阀要耐高压、耐腐蚀、死体积小、进样重复性好。
色谱柱的作用是将混合物分离成单一组份，一般由优质不锈钢管制成，管长10～30cm，内径4～5mm。柱内填充粒度为5～20μm的固定相(常用的固定相见表12．11－2)。
检测器是用来检测从色谱柱中流出的各组份。液相色谱的检测器除应具有灵敏度高、噪声小、线性范围宽、响应快、死体积小等特点外，还应对温度和流速的变化不敏感。在液相色谱法中，常用的检测器有两种基本类型，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组份的物理和物理化学特性有响应，紫外、荧光和电化学检测器等属于这一类。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应，属于这一类的检测器的有示差析光、介电常数检测器。表12．11－9列出了常用检测器及其性能。
表12．11－9 液相色谱检测器性能一览表
液相色谱仪的附属装置因使用者的要求而异，通常包括脱气、梯度洗脱、再循环、恒温、自动进样、镏份收集、数据处理等装置。梯度洗脱装置是一种很重要的附属装置，它通过按指定方式连续改变两种或两种以上溶剂的混合比例，即柱中洗脱液的极性、pH值、离子强度等，从而改变被测组份的相对保留值，提高分离效率，加快分离速度。
与气相色谱法比较，液相色谱法不受样品挥发度和热稳定性的限制，非常适合分离生物大分子，离子型化合物，不稳定的天然产物及其它各种高分子化合物等。所以液相色谱在石油化工、医药临床、环境监测、食品卫生等领域应用广泛。为了保证测量结果准确可靠，色谱仪器需作定期计量检定，检定的依据是JJG705～90实验室液相色谱仪检定规格和JJG823－92离子色谱仪检定规程，主要检定项目和技术指标概括如下：
高效液相色谱仪的主要检测项目及技术指标
1．输液泵流量设定误差SS≤±2%～5%；泵流量稳定性误差SR≤±2%～3%；
2．梯度准确度GA≤3%；
3．柱恒温度设定值误差ΔT≤±2℃控温稳定性误差ΔT≤±2℃；
4．定性测量重要性RSD8次≤1．5%；
定量测量重要性RSD8次≤3．0%；
5．检测器
离子色谱的主要检测项目和指标：1．泵流量设定误差Ss和流量稳定性误差SR
2．柱恒温箱温度设定值误差
，控温稳定性误差误差
3．保留时间重复性误差：
，
定量重复性误差
，
4．检测器
基线噪声：
，
基线漂移：
，
最小检测浓度：μg／g
线性范围：对SO42－、Na+和Ca2+≥102。
【参考文献】：
［1］王江主编，现代计量测试技术，中国计量出版社，1990。
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