常用抗体监测技术

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《蛋鸡饲养技术手册》第380页（3681字）

1．血凝(HA)和血凝抑制实验(HI) 有些家禽病毒能凝集某些动物的红细胞，病毒感染鸡后产生抑制病毒血凝性的抗体，用已知的抗体可测定新分离的病毒，用已知的抗原来测定疫苗免疫后的抗体水平，为选择最佳免疫时机提供依据，使免疫接种科学化。鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征均采用血凝抑制实验测定免疫后血凝抑制抗体的效价。

鸡新城疫病毒、减蛋综合征病毒天然具有凝集鸡红细胞的特性，传染性支气管炎病毒经胰酶或磷脂酶处理后，凝集鸡红细胞受体才能暴露出来。因此，鸡新城疫和减蛋综合征抗原为灭活的病毒尿囊液，传染性支气管炎抗原为胰酶处理的浓缩尿囊液。

本实验分两步完成，首先进行血凝实验测定抗原的凝集价，以确定鸡新城疫红细胞凝集抑制试验所用抗原稀释倍数(如果用稳定浓缩抗原，其效价已标定，可以不做本试验)。然后用定量的血凝抗原，完成血凝抑制实验，测定未知血清中的血凝抑制价。

血凝和血凝抑制实验又分为试管法、微量法。这里仅介绍微量法。

(1)试验材料

①抗原：一般用新城疫Lasota系病毒尿囊液。

②0．5%红细胞悬液：病毒对鸡个体间的红细胞的凝集能力有一定差异，所以在制备红细胞悬浮液时，应采2只鸡以上的红细胞。

采血方法可以用心脏采血法或翅静脉采血法，采血量根据需要而定，在采血前试管中加入抗凝剂(按每毫升血加入2%灭菌柠檬酸钠溶液0．2毫升)。配制红细胞悬浮液时，将血液吸入离心管中，经3000转／分钟离心5～10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞，将沉淀的红细胞加稀释液，再用3000转／分钟离心5～10分钟，弃去上清液。如此反复3次。将最后1次离心后的红细胞按0．5毫升加99．5毫升稀释液即成0．5%红细胞悬浮液。如果采血量多，需要保存时，可将血液放入红细胞保存液中(柠檬酸钠0．80克，葡萄糖2．05克，氯化钠0．42克，加蒸馏水至100毫升)。

③被检血清：采自被检鸡新鲜血液分离血清(HI试验用)。被检鸡采血比例0．2%～0．5%，1000只以下的鸡群最少采10只。

④稀释液：PBS缓冲液或生理盐水。

⑤微量反应板：常用96孔“V”型板，试验板要求清洁、干燥。

⑥25微升定量移液器及塑料吸液嘴，如无移液器可用稀释棒。

⑦微量振荡器：如无此器，也可用手摇动代替，但不能荡出孔内反应物。

(2)实验方法

①血凝实验：首先将反应板1～12孔标号，用微量滴管向每孔加入稀释液0．025毫升(25微升)。用移液器吸取抗原0．025毫升加入第一孔混匀后，吸出0．025毫升加入第二孔混均匀后，吸出0．025毫升加入第三孔，如此做倍比稀释，直到11孔为止，最后从11孔吸取0．025毫升弃去。用微量滴管每孔加0．5%红细胞悬浮液0．025毫升。在振荡器上振荡混匀(1～2分钟)，置18～22℃环境中，60分钟观察结果。每次测定样品都应同时做红细胞对照。

结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集。如果红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动或呈横线，说明红细胞被抗原所凝集。以呈现红细胞完全凝集()的病毒液的最高稀释倍数，称为该抗原红细胞凝集效价。如表14－3举例，病毒液的效价为1∶256。HI试验时，原抗原液应做256／4=64倍的稀释。

表14－3 血凝试验(HA)

注：表示完全凝集；、表示部分凝集；－表示不凝集。

②血凝抑制试验：用微量滴管在1～10孔内各加稀释液0．025毫升，第十一孔加0．05毫升。移液器连接吸液嘴后吸取被检血清0．025毫升，放入第一孔混匀后，吸出0．025毫升放入第2孔混合，如此做倍比稀释到第九孔，从第九孔吸出0．025毫升弃去。稀释其余血清前，移液器均需要更换吸液嘴。从第一至第十孔，每孔加入含4个单位的病毒液0．025毫升第十一孔为红细胞对照孔，不加病毒液。置振荡器上振荡1～2分钟，放在18～22℃静置20分钟。最后每孔再加0．5%红细胞悬浮液0．025毫升，放振荡器上振荡1～2分钟，置18～22℃，60分钟判定结果。

结果观察：如果红细胞完全沉淀在孔的底部，呈圆盘状，说明抗原凝集红细胞的作用完全被血清中抗体所抑制。以抗原凝集红细胞的作用完全被抑制的血清，最高稀释倍数为该血清的红细胞凝集抑制效价。在表14－4中，血清的红细胞凝集抑制效价为1∶64或记为HI效价6log2。

表14－4 血凝抑制试验(HI)

注：－表示不凝集；、表示部分凝集；表示完成凝集。

2．免疫扩散技术 在禽病诊断和抗体水平的测定、抗原－抗体反应分析中正在越来越多地应用免疫扩散技术。鸡病抗原和抗体在半固体的培养基如琼脂中进行扩散的时候，在高离子的作用下，互相结合而形成的抗原－抗体复合物或沉淀物，达到一定浓度时肉眼能看见特异的沉淀线。免疫扩散是一种高度特异的免疫学技术，而且成本低，程序简单。

免疫扩散技术方法很多，常用的琼脂凝胶沉淀(AGP)试验、双向免疫扩散(DID)试验，已广泛应用于以下鸡病的诊断和检测：马立克氏病、传染性法氏囊病、传染病支气管炎、病毒性关节炎、禽脑脊髓炎、禽流感、禽痘、霉形体病等。

(1)实验材料及操作

①用8%氯化钠的PBS配制琼脂糖(抗原不同配制方法不同，操作时参考试剂盒使用说明书)，浓度为1%。100℃加热融化，当温度降到55～65℃时，置入平皿中，厚2毫米，水平放置使其凝固。1次不能用完，可储存在4℃冰箱中。

②按照专用图案用打孔器打孔(图14－1)，孔径3～5毫米，孔间距2～5毫米。用真空泵吸出(或用12号针头取出)孔内琼脂糖，再用毛细吸管滴1滴融化了的琼脂糖封闭孔底，以防试剂从凝胶下面漏出。

图14－1 琼脂扩散实验打孔图案

③加样，先将平皿作好标记，第一排和第三排孔内加被检血清，第二排中第二、四、六、八、…加标准抗原；第一、三、五、七、九、…加阳性血清。加样时以加满为准，不宜溢出或出现气泡。

④扩散，如果扩散琼脂平皿不是密闭的，应将其放在1个湿盒中，或置于装有湿纸巾的塑料袋中，以防止琼脂板干燥。于37℃培养箱，扩散2～3天。

⑤结果观察，在抗原和抗体孔间出现沉淀线阳性反应。如阳性血清与未知血清形成的沉淀线相连，说明未知抗体与阳性抗体是一致的；如2条沉淀线不连成1条线，出现交叉等现象，表示二者的抗原性不尽相同。

(2)影响免疫扩散灵敏度的因素

①琼脂的质量对实验的灵敏度有影响，琼脂糖效果最好，但价格较高，用琼脂条经反复洗涤、浸泡后也能取得满意的效果。

②孔径和孔间距的大小与结果有关，孔径大、孔距近时易出现沉淀线，但出现多条沉淀线时，不易鉴别，所以孔距应适当。

③操作应仔细，防止琼脂板与下面的玻璃剥离、样品量不均、凝胶干燥等。

④用染色法提高敏感度5～15倍，先将琼脂板置生理盐水中浸泡过夜，排除游离蛋白，在用2%乙酸酒精溶液固定，最后用氨基黑染色。