组织培养育苗技术
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《花卉育苗技术手册》第60页（10096字）
组织培养也叫微体繁殖。它是根据植物细胞全能性的原理，在无菌的条件下，配制适宜的培养基，将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体等进行培养，促使其分裂分化或诱苗成苗的技术。
组织培养在花卉的繁殖上已得到了广泛应用，估计已有400种花卉进行了组织培养育苗，在育苗生产上已繁殖了多种花卉优良品种秧苗。随着科学的进步，这项技术将应用日趋广泛。利用组织培养育苗能将一部分器官繁殖成大量花苗，对于名贵品种和不容易用其他途径迅速繁殖的种类显得尤为重要。它不受季节和环境条件的影响和限制，并节省土地、劳力和时间，具有很高的增殖率。组织培养能保持原品种的性状和特性，打破优良品种的垄断，把突变枝条或花朵作为种保存下来。利用组织培养可获得无病毒苗，从而提高花卉的品质和产量。还可以用在细胞水平育种上，可在培养中取得突变体、多倍体。和其他繁殖方法比，也有一定的局限性，如成本高，手续麻烦，技术性强。一般来说，不及用种子育苗简便、低成本，也不如用无性繁殖育苗快捷。
(一)组织培养的设施和设备 组织培养需要有化学实验室，接种的无菌室，培养试管苗的恒温室，移栽试管苗的保护地，以及各种器具和药品。
1．化学实验室 化学实验室是组织培养必备的主要设施之一。一般约需15～20米2，应宽敞、明亮。在室内有供器具洗涤、晾干、配制药剂和培养基的设备；有水槽、洗涤液缸、晾瓶架；有平面实验台及安放各种药品和玻璃器皿的橱架；有各种试管、三角瓶、烧杯、量筒、吸管等玻璃器皿；有药物天平(精确度0．1克)用以称取蔗糖、琼脂等；单盘天平(精确度1毫克)用以称量培养基中的大量元素；分析天平(精确度0．1毫克)用以称量培养基中的微量元素和激素类药物。天平应放置在室内不太通风的地方，做一个水泥台，避免震动和风的干扰，不要有腐蚀性药物，应保持干燥，尽量避免搬动。
化学实验室内备有所用的无机盐、维生素、氨基酸、糖类、琼脂、生长调节剂等各种化学药品和物质。
化学实验室还应有贮藏母液用的冰箱、烘箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、过滤装置、酸度测定仪等。一般还应备有一套蒸馏器。有条件的最好专设玻璃器皿的洗涤、滤水及培养基的高压灭菌的房间，这样可以和天平、药品等需要干燥的仪器物品分开。
2．接种室(无菌室) 它是组织培养中进行植物材料的分离、接种及培养体转移的一个重要操作室。由于通常要进行长时间的无菌操作，因此无菌条件的好坏直接影响到组织培养的成败。
接种室一般由两间连在一起的房间组成，一间为接种室，另一间为准备间(缓冲间)，这样可避免进出带杂菌。接种间内有操作台，放置试管、三角瓶、酒精灯、接种工具、离心机等。室内密闭，地面和操作台及墙壁应光滑平整，采用耐水耐药的材料。室内装有紫外灯和照明灯。准备间也装有紫外灯，并有衣帽钩，供挂工作服、帽子用，另备有拖鞋。
如果经济条件差，也可用简单的木制的接种箱来代替。效果较好的无菌接种箱形状如小屋，上半部为密封玻璃窗结构，下半部与基部均为木质结构，前面在靠左、右两侧开两个孔，内侧有布袖罩，箱内上方装有紫外灯与日光灯。箱内放有接种所需物品。接种箱制作简易，成本低，但生产量大时操作不便，比较费工。
有条件的最好用超净工作台，它在操作人和操作台之间形成风幕，由于进入台面的空气净化从而保证了台面的无菌。超净工作台是以过滤器吸附杀菌的，使用时间长了会造成堵塞，应及时检查更换过滤器，通常1年清洗更换1次。有条件的最好将超净工作台放在无菌室内，这样无论是对提高无菌操作的可靠性，还是对延长过滤器的寿命都大有益处。
3．培养室(恒温室) 培养室是接种到试管等玻璃容器内的微小的植物体进行培养生长的场所。需要有控温和照明设备，要有放置玻璃容器的培养架，温度一般要求在23～27℃之间，并能调节和具有保持恒温的能力。有的需要有2～40℃之间能调节的培养柜。为了节约能源，培养室的墙壁与地板要有很好的隔热性能。
培养架上设有补光设备，分别设有1000、3000、10000勒克斯3种光照度的光源，其中1000勒克斯的光要大量设置，另两种少量设置。以日光灯为光源，一般每日光照10～16小时，应设有定时器加以自动控制。
(二)培养基及其制备
1．培养基成分
水：需用重蒸馏水(蒸馏两次)或离子水。
无机盐类：需碳、氢、氧、氮、磷、钾、硫、钙、铁、硼、锰、锌、钼、钴、碘、铜等，其中碳、氢、氧由水和空气供给，其他的需用化合物加到培养基中。
蔗糖：作为植物培养的碳源和能源。
维生素和氨基酸：如烟酸、吡哆醇、硫胺素、肌醇、甘氨酸等。
生长调节物质：主要有6－苄基腺嘌呤(BA)、玉米素(ZT)、激动素(KT)、异戊烯腺嘌呤(ZIP)等细胞分裂素和吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和2，4－D等生长素。
琼脂：作凝固剂，通常用量为0．6%～1%。
2．培养基的配方表2－1介绍了6种常用培养基配方。表中的MS培养基是Murashige和Skoog于1962年，ER是Eriksson于1965年，B5是Gamborg于1968年，SH是Schenk和Hildebrandt于1972年，HE是Heller于1953年，White是White于1943年提出的，但表中的White是于1963改良的。表2－2是上述培养基(HE除外)的附加成分。
表2－1 6种常用培养基配方
表2－2 5种常用培养基附加成分
3．培养基母液的配制和保存 为了减少每次配制培养基时对各种药品称量的麻烦，把培养基中的必需元素按原量的50倍、100倍或1000倍称量后制备成一种浓缩液，这种浓缩液叫母液。配制培养基时只要按比例分别量取稀释到所需的浓度即可。配好的母液需装在棕色小口瓶中，存放在0～4℃冰箱中，可使用半年至1年。
母液的配制是分别配制成大量元素、微量元素和维生素等。特别应注意某些无机成分在一起时，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO42－，Ca2+、Mg2+和PO43－一起溶解后会产生沉淀，所以这些成分不能在一起作母液贮存。
配制母液时要用重蒸馏水等纯度较高的水。药品应采用等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量的重蒸馏水使其充分溶解，然后依次混合。
以MS培养基为例，根据药品的特点，母液应分别配成以下6种：
母液① NH4NO3(硝酸铵) 82．5克
KNO3(硝酸钾) 95．0克
MgSO4·7H2O(硫酸镁) 18．5克
加水定容到1000毫升，浓度为培养基的50倍，配1升培养基时量取20毫升。
母液② CaCl(氯化钙) 22．0克
加水定容到500毫升，浓度为培养基的100倍，配1升培养基时量取10毫升。
母液③ KH2PO4(磷酸二氢钾) 8．5克
加水定容到500毫升，浓度为培养基的100倍，配制1升培养基时量取10毫升。
母液④ Na2-EDTA(乙二胺四乙酸二钠) 3．73克
FeSO4·7H2O(硫酸亚铁) 2．78克
加水定容到1000毫升，浓度为培养基的100倍，配制1升培养基量取10毫升。
母液⑤ H3BO3(硼酸) 620毫克
MnSO4·4H2O(硫酸锰) 2230毫克
ZnSO4·7H2O(硫酸锌) 860毫克
KI(碘化钾) 83毫克
Na2MoO4·2H2O(钼酸钠) 25毫克
CuSO4·5H2O(硫酸铜) 2．5毫克
CoCl2·6H2O(氯化钴) 2．5毫克
加水定容到1000毫升，浓度为培养基的100倍，配1升培养基时量取10毫升。
母液⑥ 肌醇 5克
甘氨酸 100毫克
烟酸(VB5) 25毫克
盐酸吡哆醇(VB6) 25毫克
盐酸硫胺素(VB1) 5毫克
加水定容到500毫升，浓度为培养基的100倍，配1升培养基时量取10毫升。
配制好的母液瓶上应分别贴标签，注明母液号、配制倍数、日期及配1升培养基时应取的量。然后放在冰箱中保存备用，以后如发现有霉菌和沉淀产生，就不能使用。
4．培养基的配制 配制培养基时要做好各种准备。先将各种母液按顺序排好。接着准备好需用的各种玻璃器皿，如量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、漏斗、培养瓶等，并放到指定位置。称取所需的琼脂、蔗糖，配好所需用的生长调节物质。准备好重蒸馏水及盖瓶用的棉塞、纸、皮筋等。把琼脂放在水浴锅上慢慢熔解。先在量筒内放入一定量的水，以免加入药液时溅开，再按母液顺序，按规定量量取先后加入。当母液加完，再加入所需要的生长调节物质。加完后倒入已熔化的琼脂中，再加入蔗糖，定容到所需体积，继续加温，不断搅拌直至琼脂完全熔解。然后用HCl(或NaOH)对培养基的pH进行调整，一般调整到5．4～6．0，应注意高压灭菌后pH又会下降0．1～0．3左右。
配制好的培养基要趁热分注到培养瓶中，一般培养基占培养容器的1／3～1／4为宜。分注时要注意不要把培养基沾到容器壁上，以免被杂菌污染。分注后及时加盖，作好标记。然后马上放到高压蒸汽灭菌锅中灭菌，在121℃、压力111千帕下维持15～20分钟。灭菌时间不宜过长，温度要严格控制在121℃，否则会引起蔗糖降解。灭菌时要注意安全，锅底水要加足，也不宜超量，盖好锅盖，拧紧螺丝。排气阀要正常，开始时要放两次蒸汽，将锅内不净空气排出，再加热升温。当达到灭菌时间后应立即断开电源。当锅内压力下降到常压时，开启放气阀，打开锅盖，取出培养基，放到培养室进行3天的预培养。当没有污染反应，即证明灭菌彻底可靠，方可用来组织培养。
(三)外植体 从植物体上切取下来用于组织培养的部分称为外植体。
1．外植体的选择 某种植物组织培养成功与否和外植体的选择是否适当关系密切。根据植物细胞全能性的理论，植物的营养器官和生殖器官皆可作为培养材料，但实际应用中则应考虑到方便、难易、效益等诸方面。为此对其取材部位、生理状况、发育年龄、取材季节、材料大小和质量等要作严格的选择。
一般都选择幼嫩的材料，如幼苗、顶芽、茎尖、侧芽等，这些部位生长速度快，代谢旺盛，分生能力强，带病毒最少，培养容易。
另外，外植体的选择还取决于下阶段芽的增殖所采用的途径。如果用侧芽增殖进行繁殖，可用枝条的顶芽和侧芽。如果通过产生不定芽的增殖途径时，则可根据不同花卉种类选择容易产生不定芽的器官作外植体，如菊花、玉簪等用的是花器官，百合和水仙等用的是鳞片或叶基部。如果利用体细胞产生胚状体为增殖途径时，可使用胚、分生组织和生殖器官作为外植体。
取材季节一般是春季最好，其次是秋季，秋季优于夏季，夏季优于冬季。因为春季植物的内源激素含量最高，生长也最为旺盛，成功的把握较大。高温高湿季节材料上易带病菌。另外，不能从病株和受泥土严重污染的植株上取材。
2．灭菌 从植物体上切取的任何外植体在接种到培养基上之前，都必须经过严格的灭菌处理，将各种微生物杀死和去掉，以避免由此而引起培养基污染而导致外植体的死亡。在消除微生物的同时还必须保存外植体的生活力。因此，使用哪种灭菌剂、多大浓度、处理多长时间，必须根据不同植物体对灭菌剂的反应来决定。表2－3列出了几种常用消毒剂的使用方法及效果。理想的消毒剂杀菌力强，容易去除，又不伤害植物材料。
表2－3 几种常用消毒剂的使用方法及效果
灭菌前应把切取的材料先用流动的自来水冲洗10～20分钟。有的材料较脏，要用洗衣粉洗涤；有的表面着生较多茸毛，影响灭菌剂的沾着，可用湿润剂以提高灭菌效果。冲洗后的材料用滤纸吸干表面水分，再在70%酒精中迅速地浸15～30秒钟，用无菌水冲洗两次，再移到2%～10%次氯酸钠水溶液中浸泡3～15分钟。具体使用的浓度和处理时间长短，需视外植体材料的老嫩、角质层厚薄来决定。灭菌后应立即用无菌水(经过灭菌的水)冲洗3～5次以去掉药液，然后用无菌滤纸吸干，准备接种。
(四)培养过程与管理
1．消毒 接种前需对所使用的玻璃器皿、工具、接种室、超净工作台、操作人员的工作服等进行严格消毒灭菌。这是保证组织培养获得成功的重要环节。对接种室要定期用福尔马林和高锰酸钾熏蒸，每次工作前用紫外灯照射20分钟，并用70%酒精喷雾降尘。超净工作台要开机15分钟使其达到充分的空气过滤消毒后再使用。
对所用的玻璃器皿应在烘箱中加热至150℃保持40分钟或120℃保持2小时。
对所用的镊子、刀、剪等采用火焰法灭菌，先在无水酒精中浸蘸，然后在酒精灯上将酒精烧去，冷却后再使用；也可用纱布包好放在高压灭菌锅内消毒。为避免交叉污染，每次用完的工具都要在酒精灯上用火焰灭菌。
对工作服、帽子、口罩等布制品，洗净晾干后用牛皮纸包好，也放在高压灭菌锅内消毒，平时应挂在接种室内，工作前用紫外灯照射。接种前操作人员必须剪指甲，并用肥皂和流动自来水洗净。然后还要用70%酒精擦拭一遍。操作时不要说话。
2．外植体的植入 一般在植入前必须对经过灭菌的外植体进行分离，分离和植入都在超净工作台上进行，操作前15～20分钟开机，并用70%酒精擦拭台面。开始工作时先点燃酒精灯。接种时，先在台内打开培养基瓶口的包纸，在火焰上烤一下瓶口，再开启瓶盖。用无菌解剖刀在无菌滤纸上把外植体切割成约1厘米小块，再用镊子把小块小心地放在培养基表面。再用火焰烤一下瓶口和瓶盖后，盖好包上原来的牛皮纸。如此即完成植入工作。然后及时写好记录，贴上标签。
如果外植体材料很小，对小茎尖进行分离用肉眼操作困难，则应在解剖镜下操作，左手拿解剖针将材料由茎的切口处刺在上面，保持于空中在镜下观察，用右手拿解剖刀，将幼叶及叶原基一一切除，使生长点露出，再用解剖刀切取，使切口朝下植入到培养基上。也可将茎尖用大头针固定在橡皮塞上，然后在解剖镜下分离切取。
对叶片、花瓣、茎等也同样进行消毒冲洗后，放在无菌滤纸上，待水吸掉后，按需要的大小切取。切取叶片时应注意每块都要带有较多的叶脉，这是由于大多数花卉植物不定芽是从叶脉部位诱导产生的。植入到培养基上应将叶面朝上，因叶背面气孔较多，有利于对培养基中养分的吸收。茎段切取时，应尽量使每段都带叶腋，因有些不定芽从此部位产生，每段长约1厘米。植入时不要将原来的上下位置颠倒，因茎有生长极性，颠倒了会影响生长。
3．培养环境条件的调控
(1)温度 温度是培养物生长的重要条件，培养物生长的最适温度大致上和该植物原来生长所需的最适温度相同。一般在20～27℃之间，培养热带植物的离体物(培养物)应偏高些，在26～27℃；培养高寒植物的离体物宜偏低些，在20～23℃。总之，(25±2)℃的温度能适合于绝大多数植物的离体生长。一般是在恒温下进行培养。但也有的要进行变温管理，夜间温度比白天低10℃左右，因花卉种类不同而异。还有一些植物需要低温处理，才能提高花粉粒产生胚状体的能力。鳞茎类植物的组织培养物在生长前以及在移栽到土壤之前一般需要低温处理，Hilderbrant认为唐菖蒲、百合的小苗必须经过在2℃条件下维持4～6周后移栽才易成活。
(2)光照
光照度：植物器官的发生在无光条件下也能进行，但进一步的生长发育必须有光。如茎尖的生长、小苗的继代增殖等，一般以1000～3000勒克斯为宜；生根成苗则应增强光照度，以3000～6000勒克斯为宜；在小苗移出前可适当增加到10000勒克斯，这样可提高移栽成活率。
光谱：紫外光和蓝色光能促进芽的分化，红色光能促进根的分化。故可根据需要调节光谱。
光照时间：光照时间通常在10～16小时。长日照植物光照时间应超过12小时，短日照植物应在12小时左右。
(3)湿度 一般情况下空气湿度考虑的不多，但在空气特别干燥时应注意保持培养室的空气相对湿度在60%～80%之间。特别对培养期较长的木本花卉，应注意防止培养基变干。
(4)气体 在培养过程中，有些培养物分泌的二氧化碳和乙烯，反过来有时会毒害培养物自身，这时应考虑到气体的影响。
4．芽的产生与增殖 花卉组织培养育苗的主要途径之一是芽的增殖，再将芽诱导生根，最后培育成苗。芽有顶芽、侧芽和不定芽之分，顶芽一般是作为外植体植入培养基的。高等植物的叶腋间有腋芽，也叫侧芽，用外源的细胞分裂素可以打破顶端对侧芽生长的抑制，促进侧芽的分化和生长。外植体上现存的顶芽和侧芽以外的任何组织器官上形成的芽，称为不定芽。许多花卉在组织培养条件下都可产生不定芽，如玉簪的花蕾能在组培条件下产生不定芽，非洲紫罗兰叶片的切块在培养基上可产生成千上万个芽。有些花卉从培养的茎尖、花芽、叶片、花丝、花托、鳞片等组织上，直接产生了不定芽，同时形成少量愈伤组织，再将不定芽切取移到生根培养基上诱导生根，这种情况也叫一步成苗法。如菊花、倒挂金钟、凤梨，以及从鳞片分化芽或小鳞茎的风信子、百合、水仙等都属于这一类型。有些花卉由茎、叶等外植体先诱导产生愈伤组织，再从愈伤组织中产生不定芽。大多数愈伤组织需转移到生长素含量低、细胞分裂素含量高的培养基上才产生不定芽，因此也叫二步成苗法。如杜鹃、非洲紫罗兰和球根海棠等的叶片培养，菊花的舌状花花瓣培养都属于这种类型。
从外植体植入培养基时起，按要求的环境条件进行控制，一般需经1～2个月的培养才能产生和长成可诱导生根的芽。有些植物种类即使诱导也不能长出新芽。遇此情况，将茎分切成若干段，使每段带1枚叶片，再植入到培养基上，使侧芽萌发、生长，以此法增殖。为促进侧芽的分化和生长以及诱导外植体产生不定芽，可在培养基里加入细胞分裂素，常用浓度为1～2毫克／升，也有用较低或较高浓度的，幅度在0．1～10毫克／升。
5．根的诱导 对于大多数花卉来说，在分化侧芽和不定芽的培养基上长出的芽是不会生根的，必须将高1～3厘米的芽切下，移到无生长素的培养基上生根。多数花卉的芽本身可产生生长素，促进生根，一般可移至无生长素的MS培养基或稀释1倍(1／2)的MS培养基上，多数经7～14天分化生根。有的可直接扦插于沙或其他基质上，如菊花、麝香石竹等。对一些较难生根的可加入0．05～5毫克／升的生长素，如萘乙酸、吲哚丁酸、吲哚乙酸等。一般草本花卉比木本花卉容易生根，扦插容易生根的组培时也易生根。为促进生根还可采取以下措施：降低培养基的盐浓度，稀释2～10倍，用适于根培养的White培养基；无根苗多次在无生长素的培养基中移植，长大后自然生根；可考虑将芽基部在100～1000毫克／升的吲哚丁酸中浸一下，再移至无生长素培养基中培养；可嫁接的用其作接穗嫁接。
在诱导生根时将糖的浓度降至1．0%～1．5%，以增强芽的自养能力，并提高光照度。降低琼脂用量，以便小苗出瓶时减少根的损伤和容易洗去培养基，琼脂用量一般降至0．8%。温度一般比诱芽阶段降低3～5℃。
6．出瓶和移植 当试管苗的根系刚刚萌发正要生长的时候(即根尖刚突出)，是试管苗出瓶移栽的最佳时期。因为此时的幼苗适应性强，生根快，适应期短，极易成活。
为保证移栽成活，试管苗出瓶前移至移栽环境中3～10天，使其适应新的温、光、湿条件。移植前1～2天打开瓶塞，使幼苗得以锻炼。
移栽时，先往瓶中注入清水，用枪形镊子轻轻将琼脂块搅碎，小心把苗取出，大的幼苗可将瓶倒过来，不易损伤枝叶。用清水漂去黏附在根部和其他部位的培养基，一定要冲洗干净，然后用旧报纸将水吸掉。
将苗移栽于基质中。基质要通透性好，干净不带杂质，蓄水和排水性能好。基质可用3份土和1份沙配制，也可用腐叶土、草炭、珍珠岩等配制，还可用沙壤土。
移植后浇清水，扣上小拱棚，保持空气相对湿度70%以上，控温20～22℃，并逐步降至16～20℃，适当遮去强光。再逐渐降低空气湿度，增加光照度，降低夜间温度，提高白天温度，使之适应栽培环境条件。