菌种保存

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第76页（3216字）

在多种理化和生物学因素的影响下，微生物的生物学特性可能发生变异。因此菌种保存是微生物学研究和应用的基础。

一、传代培养保存

是菌种保存常用的简单方法，由于细菌在人工培养基传代过程中易发生变异，所以传到一定期限时应通过一次易感动物，以保持或恢复其生物学性状。

1．斜面传代保存 将细菌接种于琼脂斜面培养基上(如普通琼脂斜面、血液琼脂斜面、鸡蛋琼脂斜面等)，置温箱18～24h培养后，将棉塞换成橡皮塞塞紧或直接将棉塞用灭菌固体石蜡熔封，移置于4℃冰箱保存。一般细菌在4℃冰箱内可保存一个月。

2．半固体保存 用穿刺接种法将细菌接种于半固体培养基内，置温箱培养18～24h后，在表面加上一层无菌液体石蜡(约1cm)，置4℃冰箱保存。一般细菌可保存3个月至半年。

传代时应先将试管倾斜，使液体石蜡流至一边，再用接种针取菌接种于新培养基上。

二、液氮保存

1．将培养18～24h的菌苔洗下，置于无菌脱脂牛乳中，制成菌悬液，分装无菌安瓿(每瓿0．1～1m1)。用喷灯封瓶口，并将封后的安瓿浸入4℃有色液体中浸30min，明确熔封后再冷冻。

2．冷冻时先将安瓿放入4℃冰箱中1h，移置冰格放1h，再置一20～一30℃低温冰箱中冻结30min，然后移置一196℃液氮中保存。

3．使用时，先将从液氮中取出的安瓿浸入30～40℃温水中迅速解冻，再打开安瓿，取出菌液接种。

在液氮中取放安瓿要防止安瓿爆炸，小心取放。

三、砂土管保存

取清洁的海砂，用1mol／L的NaOH溶液清洗，然后再用1mol／L的HCl溶液清洗，最后用流水冲洗，分装试管(约2～3cm深)，干热灭菌，加入细菌培养液1ml左右与砂土混匀，置真空干燥器内干燥，待完全干燥后熔封保存。

此法多用于梭状芽胞杆菌(如丙酮、丁酸菌)和部分霉菌的保存。可保存数年时间。

四、简易冷冻干燥法

冷冻干燥法可较长时间保存细菌的活性。简易冷冻干燥装置，亦可获得良好的效果，可供无冻干机的实验室使用。

(一)冷冻真空干燥装置 冷冻真空干燥装置由冷藏室、冷凝室、真空泵和真空表组成。

1．冷藏室：在一个12磅⁽¹⁾广口冰瓶内装入冷凝剂(约装容积的2／3)，起始温度为一20℃，并将待干燥菌液分装安瓿置广口瓶(干燥室)中，连同广口瓶放入冰瓶内，使待干燥菌液始终呈冻结状态。

2．冷凝室：在一个大广口冰瓶内装满约一60℃左右的冷凝剂，并将耐低温的冷凝管浸入冷凝剂中。其作用是将冻结的待干燥菌液的水分在真空状态下，从固体状态直接升华成气体，在冷凝管内冻结成冰霜。

3．真空泵：抽真空用。

4．真空表：测定干燥系统的真空度。

(二)真空系统 全部真空系统如图5-2所示，所有接头均用融化的封蜡(等量的蜂蜡和松香)密封，并检查有无漏气处。

图5-2 简易真空冷冻干燥装置示意图

检查有无漏气：开动真空泵抽气，5～10min后，若麦氏真空表显示的真空度达30mmHg，说明密封良好。

(三)冷凝剂 将固体CO₂(干冰)加入工业酒精中即得冷凝剂。干冰加得越多，温度越低，当酒精中干冰达饱和时，温度可降至-60℃左右。加干冰时，一次加量不能过多，以免酒精溢出。

干冰来源：商品干冰多由酒厂出售，装于冰瓶中提运和贮存，现用现买。亦可用液体CO₂冲入厚棉布袋(大约30×25cm)中获得。方法是将厚棉布袋口紧紧捆绑于装液体CO₂的钢瓶阀门上，打开阀门，让液体CO₂迅速溢出，在棉布袋内立即形成干冰，收集一定量后，关闭阀门，从棉布袋中取出干冰备用。

(四)菌悬液和干燥指示剂的准备

1．将培养于固体培养基上的幼龄菌用少量无菌脱脂牛乳洗下，稀释成10⁹～10¹⁰／ml的菌悬液；液体培养物可离心集菌后加无菌脱脂牛乳。以0．1～0．2ml量分装于灭菌安瓿底部(切勿污染安瓿颈部)，瓶口塞一无菌小棉球。同法将20%氯化钴脱脂牛乳分装于另一安瓿内(0．1～0．2ml)，作为干燥指示剂。

2．将已装好的安瓿置低温冰箱中冻结成冰，或临用前置-60℃左右的冷凝剂中冻结。

(五)干燥步骤

1．从低温冰箱取出冻结的安瓿，擦去外面冰霜，放入广口瓶中，广口瓶口用带有抽气的橡皮塞塞紧，并用封蜡密封。

2．冷藏室和冷凝室分别加入-20℃和-60℃左右的冷凝剂，迅速将盛有安瓿的广口瓶和冷凝管放入冷藏室和冷凝室中，并按图5-2接通每一个接头，放气处口和接头均用封蜡闭封。

3．开动真空泵抽气。

4．抽气约10min后，用麦氏真空表检查，若真空度达20～30mmHg，证明连接处不漏气，此后每隔30～40min检查一次。

5．自开动真空泵2h内，若真空度稳定，可逐渐提高冷藏室温度，方法是从冷藏室中取出酌量冷凝剂，加适量工业酒精，从而使冷凝剂升温。自开动真空泵约5h后，将冷藏室温度升至0℃，再经1h，将广口瓶(干燥室)移至冷藏室外，直接暴露在室温继续干燥。当干燥指示剂管由粉红色变为蓝色时，即表示被干燥物接近干燥。从开动真空泵经7～9h的真空干燥，一般可达完全干燥。指示剂管变为深蓝色，被干燥物从管壁上剥离下来为完全干燥。

6．干燥完全后，从放气口慢慢通入少量空气，然后关闭真空泵。

7．熔解干燥瓶封蜡，取下瓶塞，取出干燥的安瓿抽气焊封。

五、菌(毒)种管理注意事项

1．应由专人负责保管，存放菌(毒)种的容器应加锁或加封，并有详细分类清单，严防错乱。

2．应有严密登记制度，所有收(获)到的菌(毒)种应立即登记，注明数量、名称、株名、分离日期及地点、特性、传代冻干日期等。保管过程中的传代冻干日期及特性都应登记。

3．不再使用的培养物应及时灭菌处理，需淘汰的菌(毒)种，必须经批准后淘汰。

4．索取菌(毒)种，必须持单位介绍信，经有关领导(单位)批准，负责人签名，装入金属筒内密封，附菌种说明单，妥为运送或携带。