巴氏杆菌属

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第331页（6907字）

本属为卵圆或短杆状的革兰氏阴性菌，组织中呈两极染色。培养物在室温保存的时间较冰箱长。本属包括六个种，即多杀性巴氏杆菌(P．multocida)、亲肺巴氏杆菌(P．pneumotropica)、溶血性巴氏杆菌(P．haemolytica)、尿素巴氏杆菌(P．ureae)、产气巴氏杆菌(P．aerogenes)和禽巴氏杆菌(P．gallinarum)。各个种的不同特征见表13-1。

表13-1 巴氏杆菌属各个种的不同特性

符号说明：a．为1981年Carter氏资料b．犬与猫的菌株对甘露醇产酸可以是阴性+．90%以上的菌株是阳性-．90%以上的菌株是阴性d．11～89%的菌株是阳性。

一、多杀性巴氏杆菌(P．multocida)

本菌为球杆状或短杆状，大小约0．25～0．4×0．5～2．5μm，常单个存在，病料直接涂片用瑞特氏染色或美蓝液染色可见明显的两极染色新分离的强毒菌株，可见荚膜。革兰氏染色阴性。

本菌能使多种畜禽发生巴氏杆菌病，主要表现为出血性败血症或传染性肺炎或局部慢性感染，对畜牧业危害很大。实验动物中对小白鼠与兔子有高度致病性，注射1～10个有毒活菌，常迅速发生致死性败血症。自禽类来源的菌株对鸽子也有强的致病性。

本菌抗原结构较复杂，Robert氏1947年用小白鼠血清保护试验方法分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和IV四个血清型。Carter氏1955～1960年用间接红细胞凝集试验方法，根据不同的荚膜物质分为A、BD、E四个血清型。Namioka和Murata1961年用试管凝集试验方法分为12个菌体型，但试验指出一种抗血清和多种异型抗原存在着交叉反应，判定困难。Heddleston1972用琼脂扩散试验方法，根据不同的耐热抗原，将多杀性巴氏杆菌分为1到16共十六个血清型，他认为是一种准确可靠的方法。根据中国兽药监察所自我国21个省、市12种动物分离的217株多杀性巴氏杆菌用改进了的琼脂扩散试验，进行了血清学分型，在我国感染家禽的多杀性巴氏杆菌主要为1型，感染牛、羊为2．5型，感染猪的主要为1型和2．5型，感染家兔的为1型和3型。

(一)检验步骤

1．样品采集 活的动物可采取血液及粘液，尸体可取心血、肝，牛、猪除上述病料外，可采取病变淋巴结、肺、肾及胸腹腔内渗出液等病料。

2．镜检 血液作推片、其他脏器等以剖面作涂片各若干片、数片作革兰氏染色、数片则作瑞特氏染色。镜检有大量的革兰氏阴性两极性小球杆菌，则可初步判断为巴氏杆菌病。

3．分离细菌 将病料划线接种于血琼脂、血清琼脂或BYP培养基(酵母浸膏5g、胰蛋白胨10g、食盐4g、亚硫酸钠0．1g、葡萄糖3g、L-半胱氨酸0．5g、琼脂15g、磷酸氢二钾4g、蒸馏水1000ml、pH7．2。)，在血琼脂上24h后，可长成淡灰白色、圆形、湿润，露珠样小菌落，菌落周围不溶血。在血清琼脂上生长的菌落，于45度折光低倍显微镜观察菌落呈虹彩色。涂片染色镜检为革兰氏阴性小杆菌，即移种血斜面作纯培养，进一步进行生化反应试验。并可进行血清型的鉴定。

(二)动物试验 可将病料做成乳剂或用分离培养菌菌液皮下或腹腔接种小白鼠2～4只，每只0．2ml，一般小白鼠24～72h死亡，死后及时剖检，并作镜检和培养，以期确诊。

由于健康动物呼吸道内常常有带菌的特点，所以做细菌学检查时，最好应参照患畜生前的临床症状及剖检变化，而下最后诊断。

多杀性巴氏杆菌血清型鉴定步骤如下。

将分离培养物接种于葡萄糖淀粉琼脂上(如果菌落是显着的蓝色变异，需通过小白鼠以获得显着的粘液或光滑型菌落)。其简要步骤如下所列，详细方法见后。

1．荚膜物质的鉴定

(1)间接血凝试验

①将待检菌株接种于血琼脂或马丁琼脂(马丁肉汤加琼脂)上，培养物用3～4ml生理盐水洗下，经56℃水浴处理30min(以促进荚膜物质由菌体脱开)，用经离心分离的上清液(为荚膜抽提液)作为致敏红细胞的抗原；

②如为粘液状菌落，则先用透明质酸酶处理，即用0．1mol／L磷酸缓冲盐水(pH6)洗下菌落，在悬液中加入1ml磷酸缓冲盐水(pH6)内含15个国际配制方(50粘性—减少单位)的睾丸透明质酸酶。悬液置37℃水浴3～4h。然后经56℃水浴处理30min，离心分离取上清液作为致敏红细胞用的抗原；

③抗原致敏红细胞 方法按常规进行。致敏红细胞用生理盐水配制成0．5%悬液；

④正式试验如表13-2。

表13-2 间接血凝试验试剂的量与血清稀释度

设两管对照管(a)0．25ml生理盐水+0．25ml0．5%致敏红细胞悬液；(b)0．25ml1∶10稀释血清十0．25ml未致敏的0．5%红细胞悬液。

用力振摇试管架，使各成分充分混合，置室温约2h，看结果。然后将试管留在室温过夜第二次看结果。阳性反应出现明显的凝集。

试验也可在微量滴定板进行。每一菌株制备的抗原致敏红细胞，均分别与A、B、D、E型抗血清进行反应。

(2)用对流免疫电泳鉴定荚膜B与E型 抗原的制备与间接血凝试验同。

琼脂凝胶板按常规制备，凝固后在其上打孔，孔径3mm，两孔中心的距离7mm，将20μl荚膜抽提出液放于阴极孔内，同样的血清量放于阳极孔内，电泳槽内放满0．05mol／L巴比妥缓冲液，pH8．8，用150V电泳30min，然后检查沉淀线。出现清晰的沉淀线者为阳性反应。

(3)用透明质酸酶鉴定荚膜A型菌株 在新制备的葡萄糖淀粉或血琼脂平板上，将待检菌株横过接种于平板上，以产生约3～5mm宽的生长线。在待检菌株接种线的右角垂直地接种能产生多量透明质酸酶的金黄色葡萄球菌，接种的平板放37℃培养，定期观察直到24h。若靠近葡萄球菌生长线的待检菌株菌落变小，则可定为荚膜属A型的巴氏杆菌。因荚膜属A型的巴氏杆菌，菌体外周往往产生多量的粘液状物，成分为透明质酸；葡萄球菌产生的透明质酸酶能作用于透明质酸，能使靠近葡萄球菌生长线的A型巴氏杆菌菌落明显变小。某些D型菌株其外周也有小量的透明质酸，故靠近葡萄球菌接种线的菌落也可轻微的变小，但应注意与具有明显粘液状透明质酸的A型菌株相区别。某些A型的禽霍乱菌株不产生明显的多量的透明质酸，这些菌株只能用间接血凝试验鉴定它们的荚膜型别。

(4)用吖啶黄鉴定D型荚膜 只有显着的光滑、有荚膜的变异菌株需要检查。先把细菌接种于血琼脂或葡萄糖淀粉琼脂上，然后移种于3ml的脑心肉汤中，培养于37℃经18～24h，离心沉淀将2．5ml的上清弃去。

将1∶1000中性吖啶黄溶液0．5ml加入上述浓缩的细菌肉汤0．5ml中，混匀后将试管置室温，如菌株为D型，则发生显着的絮状沉淀，5min开始下沉，30min后沉于管底，上清透明。

显着蓝色变异的菌株易于与D型混淆，用吖啶黄处理时发生颗粒状沉淀。

2．菌体血清群抗原的鉴定 用凝胶扩散沉淀试验已证明有16种不同的菌体血清型。

(1)抗原的制备 待检菌株接种于葡萄糖淀粉琼脂平板培养18h，将细菌浓厚地悬浮于1ml的0．3%甲醛生理盐水中，在水浴中加温至100℃经1h，离心沉淀，上清液作为抗原。

(2)琼脂扩散试验 凝胶制备方法：用8．5%的NaCl溶液加入1%的琼脂和0．01%硫柳汞，将琼脂溶化，倒于玻片或平皿，凝固后打孔，1孔在中央，其他孔在外周，孔径4mm，孔与孔中心的距离为6mm，试验时标准抗血清放在外周孔，待检抗原放在中间孔，加样完毕后置37℃扩散24～48h判定，有明显沉淀线者为阳性。

3．血清型的命名 当荚膜物质与菌体抗原已鉴定，则可定血清型。荚膜型用英文字母表示，菌体抗原用数字表示。例如B∶2，A∶1，A∶3(4，12)，A∶4(7)等。

二、溶血性巴氏杆菌(P．haemolytica)

菌体呈杆状，比多杀性巴氏杆菌略长，有时呈多形，可见两极染色，但用普通显微镜方法检查常不能证明荚膜的存在。新分离的菌株在菌落周围有透明溶血圈，经连续继代培养后，溶血性减弱或消失。在羔羊血琼脂上可形成双溶血圈。对肉汤中的绵羊红细胞悬液无溶血作用。能生长于麦康凯琼脂上。

(一)致病性 可致绵羊肺炎、羔羊败血症、牛运输热、牛巴氏杆菌肺炎、羊或牛的乳房炎、鸡的霍乱样疾病、青年母鸡的输卵管炎。

(二)分型 溶血性巴氏杆菌按其生化反应和致病性可分为A、T两个生物型(见表13-3)，又按其表面抗原用间接血凝反应可区分为12个血清型。

表13-3 溶血性巴氏杆菌两个生物型的特性

注：+示产酸，-示不产酸。

(三)检验步骤

1．样品采集 如多杀性巴氏杆菌，母羊乳房炎可采集乳。

2．培养 可将病料接种于血琼脂、麦康凯琼脂，在血琼脂上生长的菌落与多杀性巴氏杆菌相似，但菌落较小，菌落周围有溶血圈，在羔羊血琼脂上形成双溶血圈，能生长于麦康凯琼脂上，不产生靛基质，这些特性可与多杀性巴氏杆菌区别。

三、亲肺巴氏杆菌(P．pneumotropica)

本菌呈杆状，大小0．5×1．2μm，有时较长，不常见到两极染色。

此菌存在于许多小白鼠群中，是一种潜在的病原体，当动物进行实验时，当环境中存在其他病原体或应激因素时，可激发小白鼠、兔子与其他实验室啮齿类动物发生呼吸道感染与脓肿，对SPF动物有高度致病性。也曾从豚鼠、仓鼠、鼠、狗分离到此菌，有时也存在于人的呼吸道。Winton与Mair认为此菌是多杀性巴氏杆菌尿素变异株。

检验步骤如下。

1．样品采集 此菌能从感染动物的肺、眼、子宫、肾、心血、腹腔液分离到，故可采集上述样品。

2．培养 其程序与多杀性巴氏杆菌相同，在血琼脂上于37℃经24h生长的菌落直径约1mm、完整、隆起、灰黄色、不溶血，在麦康凯琼脂上不生长，能产生靛基质，分解尿素，不液化明胶。

3．动物接种 小白鼠采用鼻腔接种方法是易感的，但用其他常规的接种途径有抵抗力。大鼠、兔、鸡对感染有抵抗力。

四、尿素巴氏杆菌(P．ureae)

本菌为杆状、多形，根据生长的培养基而有不同，常见有两极染色。

在健康人的鼻部不常见，有时在臭鼻症病例或其他呼吸道感染中发现。

五、产气巴氏杆菌(P．aerogenes)

本菌为球杆状，大小0．5～1×1．1～2μm，在较老龄的培养物中，可见达6～15μm的菌体。

在血琼脂37℃培养48h后呈圆形光滑隆起透明直径0．5～1mm的菌落，在胰蛋白胨与麦康凯琼脂中生长同样良好。在麦康凯培养基培养24h形成似沙门氏菌菌落，继续培养可获得淡红色菌落。不能生长于S．S．琼脂上。

在三糖铁琼脂斜面上产酸，底层产酸有气体，不产生硫化氢。产生半乳糖苷酶。不能利用枸橼酸。

六、禽巴氏杆菌(P．gallinarum

本菌为球杆菌，大小0．5±0．1×1．5±0．5μm，再次培养后有些可形成10μm或更长的菌体，呈两极染色，新分离培养物有荚膜形成。

在血清或葡萄糖淀粉琼脂上产生有荧光的菌落，圆形光滑边缘整齐。

葡萄糖淀粉琼脂(Dextrose starch agar)的制做方法如下。

蛋白胨(proteose peptone) 15g

葡萄糖 2g

可溶性淀粉 10g

氯化钠 5g

双盐基磷酸钠(即磷酸氢二钠) 3g

明胶 20g

琼脂 12g

加热将各物溶解，调pH至7．4，装瓶或试管，121℃15min的高压灭菌后，倾注成平板或摆成斜面备用。

此培养基除用于巴氏杆菌外，还可用于链球及致人类疾病的淋球菌、脑膜炎球菌等的分离培养用。

脑心浸汤(Brain heart infusion broth)及脑心汤琼脂(Brain heart infusion agar)的制备方法如下。

先制备脑浸汤及心浸汤。将羊脑或牛脑组织，去脑膜，称重，磨碎，称重。按1g组织加水1ml比例混匀，煮沸1h，先纱布后滤纸过滤，是为脑浸汤。如不立刻用，装瓶，121℃高压灭菌15min后，保存备用；同样操作，以牛心代脑组织，制得心浸汤。

取脑浸汤200ml，与心浸汤250ml混匀，加入蛋白胨10g，氯化钠5g，磷酸氢二钠2．5g，葡萄糖2g，加水至总量为1000ml，加热至各物溶解，调pH至7．4，煮沸1h，滤纸过滤使清亮，分装，121℃高压15min。是为脑心肉汤。

调pH前如加入琼脂15～20g，并加热使琼脂融解，再调pH，煮沸，纱布过滤，分装，高压，是为脑心汤琼脂。

此培养基营养成分丰富，能供巴氏杆菌、链球菌、棒状杆菌、脑膜炎球菌、淋球菌、放线菌、梭菌及一些病原真菌的生长。