细胞的保存和递送

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第564页（1938字）

传代细胞系和二倍体细胞株，有时甚至继代细胞常常需要在实验室中长期保存，以备随时取出复苏后使用。保存方法一般都在细胞培养中加冷冻保护剂，然后贮存于低温。常用的保护剂有2种：试剂级的甘油或二甲基亚砜，浓度为5～10%，作者经验5%已经足够，这样复苏时将细胞悬液稀释后对细胞的毒性甚微。甘油在分装青霉素瓶后经121℃高压蒸气灭菌；二甲基亚砜则须经过滤灭菌，分装青霉素瓶，密封，贮存于4℃(在18℃以下即冻结)。每次用1瓶，剩余弃去，否则容易被细菌污染，而且开瓶后接触空气而被氧化裂解。

一、低温冰箱保存

将细胞保存于-90℃以下大多数可生存几年，在-70℃以下可生存6个月，在-65℃以上只能作短期保存。

(一)冷冻

1．细胞必须健康，形态正常，长成单层时即需保存，太老效果不良。

2．保存前夕需换新生长液。

3．将生长液弃去，细胞单层用Hanks液洗一次，用胰蛋白酶使细胞自玻片消化下来(与细胞传代完全相同)。

4．用保存培养液将细胞浓度稀释到1～2×10⁶／ml。保存液的配方为：

Eagle氏MEM 75～80ml

犊牛血清 15ml

二甲基亚砜(或甘油) 5～10ml

青、链霉素 各100IU／ml

pH7．2

5．分装安瓿或青霉素瓶(密封)，每瓶1～2ml。

6．每瓶上用脂溶性记号笔写明细胞种类和日期。

7．装于铝饭盒或其他容器内，置于-70℃以下的冰箱内贮存即可。温度下降的速度一定要慢，最好为1℃／min，但一般实验室难以控制。

(二)复苏

1．将安瓿(或青霉素瓶)自冰箱取出，立即投入37℃水中并加摇动使其迅速融化，越快越好。

2．将细胞悬液移入培养瓶内，加9倍量的生长液，在37℃培养。

3．越夜，倾去培养液，换以新生长液，以后与常规培养同。

4．也可将融化的细胞悬液加9倍生长液后用1000r／min离心10min，弃去上清液，再用同量生长液悬浮细胞，则可省略步骤3。

二、液氮保存

液氮的温度在-196℃，液氮蒸气为-170～-180℃。细胞在此低温下可以生存许多年，存活率在95%以上，两种温度的效果基本一致，根据实验室条件任选一种。

(一)冷冻 要求与低温冰箱保存相同。分装于安瓿或青霉素瓶内，每瓶1～2ml。

如保存在液氮中必须用厚壁的硬质玻璃安瓿，封口时绝对不能漏气，否则取出时有爆炸危险。检验方法可准备一杯已冷至4℃的0．1%美蓝溶液，将封口的安瓿投入浸没，在冰箱中放置30min。如封口不密，美蓝溶液就被吸入安瓿内，应弃去。如保存在液氮蒸气中，则安瓿和加铝盖密封的青霉素瓶均可。

在-70℃放置几小时甚至过夜，然后贮于液氮或其蒸气中。

(二)复苏 与低温冰箱保存同。细胞悬液融化后，细胞基本上都沉在管底，作者是将上清吸出弃去，换以生长液使细胞悬浮，这样在培养过夜后不必再换新生长液。

三、细胞培养的递送

低温保存的细胞在递送时可装在干冰盒内，这在目前我国尚难办到。常用的方法是在细胞长成单层后弃去培养液，注加新生长液到满瓶，塞紧，冬天装在内衣口袋中携带，3～5天不受影响。如在温暖季节，且数量较多，可装在硬泡沫塑料箱内携带，甚至邮递，但要保证培养瓶不破碎和不泄漏，瓶外要塞以大量吸水的填充物。