病毒核酸类型的测定

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第589页（4437字）

一、卤化核苷酸法

氟脱氧尿核苷(FUDR)、溴脱氧尿核苷(BUDR)和碘脱氧尿核苷(IUDR)的化学结构与胸腺嘧啶核苷极为相似，是它的同功异质体，因此可以取代后者，结合到病毒的DNA中去，使其遗传性能遭受破坏。它们是核酸代谢抑制剂，当它们的浓度达到10-5mol／L时，DNA病毒的复制即被抑制，但绝大多数RNA病毒不受影响，只有反录病毒例外，因为它们的繁殖早期需要DNA的合成。

(一)应用时必须注意的事项

1．代谢抑制剂对细胞有一定毒性，因此使用前要测定细胞对它的耐受力，以消除非特异抑制效应。

2．在维持液中不应含有胸腺嘧啶核苷，因此最好用Eagle氏MEM，不要用199或1640等复杂的综合营养液。

3．要设置已知RNA和DNA病毒对照，以及不接种病毒的空白细胞培养对照。

(二)试验步骤

1．细胞长成单层后倾去营养液，换以含FUDR(或其他卤化核苷酸)50μg／ml的新营养液，在37℃培养过夜。

2．已知和待检病毒作连续10倍稀释。

3．倾去细胞营养液，用Hanks液洗1次，接种病毒悬液，每一稀释度接种4管，在室温或37℃吸附1h后加入新营养液。含FUDR50μg／ml和不含抑制剂的营养液各2管。

4．37℃培养，每天检查细胞病变(CPE)。对于无CPE的病毒则用其他指标检查。

5．当正常营养液管的CPE已经明显时即可判定结果。加抑制剂的病毒滴度低于对照管超过2个滴度时即判为DNA病毒，否则为RNA病毒。各对照管均应正常，即：RNA病毒对照管不被抑制，DNA病毒对照管有明显抑制，空白细胞培养生长正常。

二、放线菌素D(Actinomycin D)法

放线菌素D是一种多肽类抗生素，它能与细胞和病毒的DNA结合，抑制依赖于DNA的RNA合成，但不抑制依赖于RNA的RNA合成。因此它可以区分DNA和RNA两类病毒，前者被抑制可达95%，后者不受影响。但是有3类RNA病毒是例外：(1)呼肠孤病毒——它的基因组为双股RNA，转录RNA时与DNA相仿；(2)正粘病毒和反录病毒——它们在复制周期中某阶段依赖于DNA，因此对放线菌素D敏感。

试验步骤如下。

1．用细胞培养测定细胞对放线菌素D的耐受浓度(10、1．0、0．1μg／ml)。

2．配制细胞培养营养液，同时加入放线菌素D，使达这个浓度(一般为5～10μg／ml)。

3．待检病毒和已知对照病毒(DNA和RNA病毒)作连续10倍稀释，每一稀释度各接种4管细胞培养，室温或37℃吸附1h。

4．一半细胞培养管加入含放线菌素D的营养液，另一半加正常营养液。

5．在37℃培养，每天观察CPE。

6．当不含放线菌素D营养液的细胞管中CPE已经明显时，即可判定结果。特检病毒被抑制超过2个滴度者即为DNA病毒。同时必须(1)RNA病毒对照管不被抑制；(2)DNA对照管明显抑制；(3)不接种病毒的细胞培养对照管生长正常。

三、吖啶橙染色法

吖啶橙(acridine orange，AO)是一种荧光染料，在适宜条件下能与单股核酸广泛结合，结合染料的单股核酸分子的吸收光波从原来(游离染料)的490nm转移到465nm，结果在紫外线照射下发出红色荧光。当染料与双股核酸相遇时，结合甚为轻微而且容易解离，吸收光波从490nm转移到502nm，结果发出绿色荧光。因此本法可以测定核酸的股数。

(一)AO染色时必须注意以下事项

1．细胞核糖体 AO易与核糖体的单股RNA结合，发出红色荧光，而且某些病毒的CPE常对核糖体有影响，在检查时要注意区分。

2．浓度与pH 当AO溶液浓度超过0．05%，pH高于6时，整个细胞发出红色荧光。因此适宜的浓度为不超过0．01%，适宜pH为3．6～5．2。

3．固定液 固定的目的是使细胞膜的通透性增强，常用的Carnoy氏固定液效果良好，冷丙酮甚至不固定效果也好。不能应用含有苦味酸或镍酸的固定液，否则荧光强度会降低。

4．染色过程 染色液必须新配，染色时间不能过久，漂洗液最好使用McIlvaine氏缓冲液而不用PB。

(二)染色步骤

1．几种溶液的配制方法。

(1)Carnoy氏固定液

冰醋酸 1份

无水酒精 6份

氯仿 3份

(2)McIlvaine氏缓冲液(pH3．8)

0．1mol／L 枸橼酸 12．9ml

0．2mol／L Na₂HPO₄ 7．1ml

(3)0．01%吖啶橙染液 10mg吖啶橙溶于100ml McIlvaine氏缓冲液中，装棕色玻瓶，冰箱贮存。

2．组织触片、冰冻切片或盖玻片细胞培养在Carnoy氏液中固定5～10min。

3．在100%、80%、70%、50%酒精溶液和蒸馏水中漂洗各3min。

4．在McIlvaine氏液中放置5～10min。

5．在吖啶橙染液中染5min。

6．用McIlvaine氏液漂洗2～3min。

7．在载玻片上加1滴McIlvaine氏液，加盖玻片(如为盖玻片细胞培养则将细胞单层向下)，用450nm光波(高压汞灯加蓝紫色滤光片)在荧光显微镜下观察。

8．结果判定。正常细胞核呈黄绿色，核仁桔黄色，细胞浆暗红色。感染细胞的核中双股DNA病毒呈黄绿色荧光小颗粒，包涵体可能呈不同形状。在细胞浆中繁殖的双股DNA或双股RNA病毒在红色背景中发出黄绿色荧光，单股RNA病毒发鲜红色荧光。

快速染色法 此法适用于盖玻片细胞培养。

1．将待检盖玻片细胞培养用PBS漂洗3次。

2．Carnoy氏液中固定5min，空气中干燥。

3．4℃可贮存几天，或立即染色。

4．AO染液中染5min。

5．McIlvaine氏液中漂洗2次，每次3min。

6．在载玻片上加1滴McIlvaine氏液，将盖玻片培养覆于其上，于荧光显微镜下观察。

四、放射性同位素标记法

此法可直接测定病毒核酸的类型，但要求病毒充分提纯，使不含细胞核酸，以免干扰结果判定的正确性。

试验步骤如下。

1．细胞培养接种已知和待检病毒，还有不接种病毒的正常细胞培养。

2．营养液中加入³H-5-尿核苷或³H-胸腺嘧啶核苷(也可用¹⁴C代替³H)，最后浓度为37000Bq／ml(注：1Ci=3．7×10¹⁰Bq)。

3．在37℃培养8h。这要求很严格，因为病毒核酸在此时间内合成。

4．从细胞或培养液分离和提纯病毒(空白对照同样处理)。

5．将病毒液滴于层析纸上(厚0．33mm，大小为3×3cm²)，使之全部吸收(约4滴)。对照空白液同样处理。

6．不待干将每张滤纸分别放在一只烧杯中，内盛4℃的0．5%过氯酸150ml，冰箱放置30min。

7．弃去过氯酸溶液，加入30ml的冷(4℃)95%乙醇，稍摇弃去。

8．换加150ml的冷(4℃)95%乙醇，冰箱放置至少2h。在此期间必须换酒精一次。

9．弃去酒精，将滤纸烘干。

10．将干燥的滤纸放在液体闪烁瓶内，加入足够的闪烁液(PPO-POPOP，用甲苯配制)，使滤纸浸没。如纸显示颜色，表明过氯酸未完全去净。

11．将瓶盖上，用液体闪烁计测定放射量。比较待检病毒、已知病毒和空白对照的差别。