弓形虫病间接血凝试验操作技术

出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《动物检疫手册》第70页（1309字）

(一)材料准备

1．被检血清：经56℃30分钟灭活保存在4℃下备用。

2．阳性血清和阴性血清：阳性血清的抗体滴度要求在1∶1024以上，阴性血清滴度要求在1∶4以下。

3．冻干致敏红细胞：用前24小时用蒸馏水洗涤一次，随即用含2%正常兔血清的磷酸盐缓冲液(以下简称2%NRS)加至瓶笺注明量到时使用。冻干致敏红细胞的凝集抗体滴度应在1∶1024以上者才合格。

4．主要检测器材：96孔(12×8)110度“V”形孔底的聚苯乙烯微量反应板、0．025毫升容量的微量移液器和微型振荡器等。

(二)操作方法 试验设被检血清排、阳性血清稀释排和阴性血清稀释排，每排前7孔为血清稀释孔，第8孔即最后1孔为2%NRS空白对照孔。具体步骤如下。

1．先用移液器给每孔滴入2%NRS0075毫升，再以移液器分别吸取各被检血清、阳性血清和阴性血清0．025毫升于各自排的第1孔内，同时充分混匀再吸0．025毫升至第2孔，如此依孔序逐个稀释至第7孔，使相连孔均呈4倍递增稀释，第8孔不参与血清稀释液作为2%NRS空白对照。

2．再用移液器从各稀释排的第1孔开始向后逐孔滴入预先洗涤稀释的冻干致敏红细胞悬液0．025毫升，并立即将反应板移到微型振荡器上振荡混合1－2分钟后于室温(或22℃恒温箱中)静置2小时观察结果。

(三)结果判定

1．凝集标准有以下5种。

“#”：为100%红细胞在孔底呈均质而致密的膜样凝集。

“+++”：为75%红细胞在孔底呈均质的膜样凝集，不凝集的红细胞在孔底中央沉淀成小圆点。

“++”：为50%红细胞在孔底呈均质而疏松的膜样凝集，不凝集的红细胞在孔底中央沉积成较大的圆点。

“+”：为25%红细胞在孔底呈稀疏的凝集，不凝集的红细胞在孔底中央沉积成更大的圆点。

“-”：为100%红细胞在孔底沉积成圆点状，周围液体完全透明。

2．判定标准。通常以1∶64以上被检血清稀释孔呈现“50%以上”凝集者，可判为阳性反应。血清抗体滴度高低，则以呈现“++”凝集的终末孔的稀释倍数来表示。如某一被检血清的凝集情况是1∶64(++++)，1∶256(十++)，1∶1024(++)，1∶4096(+)，那末该血清即可判阳性反应，其抗体滴度为1024。