兔病毒性败血症微量血凝(HA)试验操作技术

出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《动物检疫手册》第164页（1789字）

(一)材料准备

1．待检肝悬液：将病死兔肝脏剪碎，再以4000转／分离心30分钟。去上清液做血凝试验。

2．正常兔肝悬液：取健兔肝，同上法制成1∶10悬液作对照用。

3．标准阳性血清：取健康兔4只，肌肉注射本病疫苗1毫升，然后分别在15天，30天时注射强毒1毫升和2毫升，最后1次注射后10天试血，当HI效价达到1∶128时，采血制备诊断血清。

4．人红细胞悬液：新鲜O型人红细胞，用20倍量的生理盐水洗涤3次，最后以2000转／分离心15分钟，吸取压积细胞，用生理盐水配成1%悬液。

5．常用器材和溶液：包括离心机，96孔微量滴定板、标准滴管(每滴0．025毫升)或微量稀释器、微量混合器、离心管、试管、吸管和生理盐水等。

(二)操作方法

1．在96孔V型微量滴定板上，从第1孔至第11孔，每孔加入生理盐水1滴，然后在第1孔加入1∶10的病兔肝悬液1滴，第12孔加1∶10的正常兔肝悬液1滴，从第1孔开始，用标准滴管作倍比稀释至第10孔，最后1滴稀释液弃去。

2．每一检样稀释2排：第1排为HA试验，每孔加生理盐水1滴，第11孔是生理盐水对照，第12孔是正常兔肝悬液对照。第2排为HI试验，每孔加1∶10标准阳性血清1滴，第11孔为阳性血清对照。

3．每孔各加1%人红细胞1滴，立即在微型混合器上摇匀，置室温45分钟，待对照完全沉淀后观察结果。

4．本法用于毒价滴定时，检样可连续稀释2排，至10×2^－20，并可不作HI对照。

5．脏器用福尔马林灭活后仍可作HA试验，用前以1000转／分离心15分钟。取上清液供试，但HA价比未灭活前低3－4滴度。

6．红细胞悬液稀释后，置4℃冰箱可保存3－4天，未洗涤的抗凝血在4℃冰箱可保存7－10天，上清液明显溶血时，弃去不用。

7．可用过锰酸钾固定红细胞代替新鲜红细胞，但反应需在4℃冰箱进行。

(三)结果判断

1．血凝程度以不同加号表示：

“#”：红细胞均匀铺于孔底，强阳性者边缘卷曲呈荷叶边状。

“+++”：基本同上，但边缘不卷曲，红细胞有下滑趋向，孔中心密度较大。

“++”：约半数红细胞凝集，分散于孔底，半数不凝集，沉降于孔中心，呈粗糙的小圆点。

“+”：红细胞沉降呈小圆点，边缘不光滑，四周有少量分散红细胞。

“－”红细胞沉于小孔中心呈边缘整齐的小圆点。

2．++以上凝集为判定终点，出现++以上凝集的最大稀释度为该检样的HA价。

3．生理盐水对照和正常肝悬液应为阴性。出现阳性者，为非特异性凝集，试验不成立。

4．第2排HI试验的HA价应显着低于第1排，表明血凝被抑制，为特异性凝集，判为阳性。二排HA价相等或二者差异小于2个滴度者，为非特异凝集或为其他病毒引起的血凝，应判为阴性。

5．放置时间太久时，强阳性孔亦可沉降于孔底，与阴性孔不易区别，可将滴定板直立放置数分钟，阴性孔红细胞下滑，呈感叹号状，不下滑判为阳性。