茚三酮比色法测赖氨酸

出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《土壤农化分析手册》第581页（1818字）

(一)适用范围 茚三酮在一定碱性条件下可与谷物蛋白质中赖氨酸的ε-NH₂反应，并在有镉离子存在时生成红色化合物，红色化合物愈深，蛋白质中赖氨酸愈多，故可定量测定赖氨酸含量。但此反应并不专一，样品中游离氨基酸及蛋白质也会与茚三酮反应。故本法虽简便，灵敏，但只能做为一个粗放的筛选法。

(二)试剂配制

1．茚三酮显色液 称取茚三酮1g，氯化镉(CdCl₂·2．5H₂O)2g于100ml棕色容量瓶中，加入25ml甲酸钠缓冲液溶解，再加入乙二醇至刻度。充分摇动，在室温下放置一天使用。应现用现配，最多两天。若有沉淀，应过滤后使用。

2．甲酸钠缓冲液 称取30g甲酸钠，溶解于约60ml水中，加入10ml88%的甲酸，用蒸馏水稀释至100ml。

3．2%碳酸钠。

4．4%碳酸钠。

5．1∶1乙醇液 取95%乙醇500ml，用蒸馏水稀释至1L。

6．亮氨酸标准溶液 精确称取在105℃下烘2h的亮氨酸50．0mg置一小烧杯中，加约1ml0．5N盐酸，待溶解后，用蒸馏水移至100ml容量瓶中，定容摇匀。此标准母液浓度为500μg／ml。分别吸取此母液2，4，6，8，10，12，14ml，放入25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至刻度。摇匀备用，此系列标准液浓度分别为40，80，120，160，200，240，280mg／ml。

(三)测定步骤 准确称取风干磨细通过0．25mm孔径的样品(油料作物种子须经脱脂，玉米可去胚后磨碎，其它含油少的种子可直接风干磨碎)30mg，放入试管，加入0．3g干净的细石英砂及1ml2%碳酸钠，用圆头玻棒充分研磨2min，然后放入80℃恒温水浴中提取10min。同时做一试剂空白(即只加0．3g细石英砂，不加样品)。取出试管，各加2ml茚三酮显色液，摇匀，在80℃水浴中保温显色30min。取出立即放入冷水浴中冷却，3min后再向各试管加入1∶1乙醇液10ml，摇匀，过滤或取其清液，用绿色滤光片或在520nm波长处、10mm杯径与空白一起测定吸光度。

工作曲线绘制：吸取水及40，80，120，160，200，240，280μg／ml亮氨酸系列标准液各0．5ml于试管中，各加0．5ml4%碳酸钠，混匀，加入2ml茚三酮试剂，充分混匀后放入80℃水浴中保温30min。以下步骤同样品测定。以吸光度为纵座标，亮氨酸微克数为横座标绘制工作曲线。系列标准液亮氨酸微克数为20，40，60，80，100，120，140。

(四)结果计算

式中：D——根据样品吸光度在工作曲线上查得对应的亮氨酸减去空白后的微克数；

1．11——标准液由亮氨酸配制，此为由亮氨酸换算成赖氨酸的因数；

A——样品修正值，指样品中游离氨基酸量。不同作物修正值不同。小麦0．05%，高粱0．04%，水稻0．01%，玉米0．01%。

如计算结果欲以蛋白质百分数表示时，则将计算结果被其蛋白质量除，取其百分数即可。

(五)注释

①亮氨酸碳原子数目与赖氨酸相同。由于亮氨酸有一个氨基，相当于蛋白质中赖氨酸的ε-氨基，二者与茚三酮反应机理相同，所以通常用显色稳定的亮氨酸制成标准溶液，绘制工作曲线。

②测定时保温和提取时间必须准确控制。大批样品分析时，可先将试管放于铁丝筐中，每筐带一个空白，放入水浴中后，要不停摇动铁丝筐，以保持水温均匀。水浴温度应严格控制在80℃。