器材和试剂

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《农作物品种鉴定手册》第126页（7578字）

1．器材

(1)圆柱电泳槽；

(2)凝胶电泳玻管 内径5－6mm，外径7－8mm，长度100mm，两端用金刚砂磨平。管的内径要均匀一致，最好由同一玻璃截断制成。用洗液浸泡，用水洗净烘干备用。

(3)小玻塞将直径与凝胶玻璃管相同的玻璃棒，截成约1cm长，两端磨平。用时以乳胶管与凝胶玻璃管相连。

(4)5或10ml注射器和1ml注射器。

(5)注射针头(20号)和10cm长注射针头(5或6号)。

(6)50或100μl微量进样器。

(7)电源：直流稳压电源，电压400－500V，电流100mA。

2．试剂

(1)0．2M、pH7．2磷酸缓冲液 取280ml0．2M磷酸二氢钠溶液，再加入720ml0．2M磷酸氢二钠溶液，混和均匀后在pH计上调至pH7．2。

(2)样品溶解液 0．01M，pH7．2磷酸盐缓冲液，内含有1%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0．02%溴酚蓝。用来溶解待测样品。其配制方法如下：

SDS 100mg 甘油 1ml

巯基乙醇 0．1ml 溴酚蓝 2mg

试剂2 0．5ml，

最后加蒸馏水至总容积10ml。

(3)电极缓冲液为0．1%SDS，0．1M，pH7．2磷酸盐缓冲液取1g SDS，加入500ml试剂2，用蒸馏水定容至1000ml。

(4)染色液 称取0．25g考马斯亮蓝R－250，加入454ml50%甲醇水溶液和46ml冰醋酸。

(5)脱色液 75ml冰醋酸，875ml蒸馏水与50ml甲醇混合。

(6)SDS纯化 市售化学纯SDS需重新结晶后使用。重新结晶方法如下：称取20g SDS，放入500ml圆底烧瓶中，加进约半骨匙的活性炭及300ml无水乙醇，搅拌，摇匀。烧瓶上接上一个小冷凝管，放在水浴上加热至乙醇微沸，回流约10分钟。然后用热过滤漏斗热过滤。滤液应透明无色，并冷却至室温后，移至－20℃冰箱中过夜。次日，通过预冷的布氏漏斗抽滤。用少量－20℃无水乙醇洗沉淀3次，尽量抽干。将结晶置于真空干燥器中干燥或40℃以下烘箱中烘干。

3．操作方法

(1)贮液和凝胶的配制 贮液和凝胶溶液的配制方法如表11－2。

表11－2 贮存液及凝胶溶液的配制

表中：Acr：丙烯酰胺；Bis：甲义双丙烯酰胺；TEMED：N，N，N¹，N¹，一四甲基乙二胺。

注：贮液放置冰箱保存。SDS会在低温下析出，使用前用微温使溶化。贮液Ⅳ每二周新配一次。

SDS-PAGE电泳可采用圆柱电泳或垂直板电泳。本节将以圆柱电泳为例介绍如下。

将凝胶玻璃管插入电泳槽上槽底部的圆孔中，使其垂直。玻璃管底部套上小玻塞。在套上前在小玻璃塞的表面均匀地涂一薄层50%甘油。

从冰箱取出的贮液平衡到室温后，按上表中10%凝胶的比例混合。混合液置于真空干燥器中用水泵抽气10分钟后，加入10%过硫酸铵溶液，混匀后立即用细滴管将胶液加到凝胶玻璃管中，凝胶高度为7cm，尽量使每管凝胶高度一样，最好事先画好刻度。加完胶液后，立即用带有细针头的注射器沿管壁轻轻向胶面加入蒸馏水约3－4mm高度，静置数分钟后，水和胶界面消失，的20－30分钟重新出现界面，再放置30分钟即可加样。

制胶时须注意，向胶液表面加蒸馏水时，切忌水成滴坠入，而应沿管壁缓慢流下，否则，顶部凝胶浓度会有较大的稀释。这将影响样品的迁移率而降低测定结果的准确度。

(2)样品制备 一般是将蛋白质溶解在含有1%SDS、1%巯基乙醇的0．01M pH7．2的磷酸盐缓冲液中，在100℃加热2－5分钟。蛋白质的最后浓度一般为0．05－1．0mg／ml。

据S．F．Gardiner等(1986)研究，羊茅和黑麦草种子可用十二烷基硫化钠缓冲液提取。鸭茅醇溶蛋白提取是称取40mg粉，加入0．8ml按1∶1比例混合40m M Tris－硼酸缓冲液(pH8．6)和2%β－巯基乙醇在50℃浸提1小时。经研磨离心，再加入0．2M15μl二硫苏糖醇混合提取30分钟，再加15μl0．5M碘乙酰胺进行蛋白质乙酸化，再移入4℃下渗析一夜，离心，使用前放在85℃水浴里加热10分钟。

处理好的样品提取液可用于电泳。对于直径为6mm的凝胶柱管加10μg蛋白质(或更少)便可以得到清晰的区带。根据样品溶液的浓度，加样体积可由10－150μl。

经处理好的样品提取液也可放在冰箱中保存较长时间，使用前在100℃水浴中加热1分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合物。

(3)电泳 轻轻取下凝胶管底部的小玻塞。注意保持玻管垂直装置在电泳槽上，将电泳槽倾斜过来，使凝胶管口斜向下方，用滴管轻轻吸去流到胶管口的水。先将电极缓冲液倒入下槽，并将上槽轻轻放下，稍转动，以除去凝胶管底部可能有的小气泡。也可用带弯的滴管轻轻吸去。然将电极缓冲液注入上槽，必须满过管口。

用微量进样器按号向凝胶管中加样。每管加一种样品。各加20μl(含蛋白质10μg)，稀溶液最多可加150μl。

加样完毕后，打开直流稳压电流(负极接上槽，正极接下槽，事先接好)。将电流调到每管8mA，保持电流强度不变。待指示染料(已事先加在样品溶液中)，迁移到离下口约1cm处时，停止电泳，约需4．5－5．0小时。

(4)染色和脱色 从电泳槽上取下凝胶管，用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入凝胶与管壁之间，一面轻轻旋转玻璃管，一边推针前进，并注水，使凝胶剥离璃管而滑出。在染色区带中心插入细铜丝作标记，按编号放入试管，加入染色液，染色4小时或过夜。次日倒去染色液，用蒸馏水漂洗胶柱数次后加入脱色液，数小时换一次脱色液，直至背景清晰，约需一昼夜。

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