器材和试剂
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《农作物品种鉴定手册》第132页（6733字）
1．器材
(1)稳压器(EPS400／500)。
(2)电泳仪(150mA、2．5kV)。
(3)凝胶模架(315×120×5mm)和装有白金电极的有机玻璃电泳槽。
(4)微孔多孔穴模板。
(5)实验用银质混合器。
(6)不锈钢丝(0．003mm直径)。
(7)玻璃板(285×118×2mm，285×118×3mm)。
(8)塑料胶带纸。
(9)样品槽梳模。
(10)酸度计、分析天平、滤纸(3#)、密闭塑料盒及玻璃器皿等。
2．试剂
(1)水解淀粉。
(2)乳酸铝。
(3)乳酸。
(4)尿素。
(5)2－氯乙醇。
(6)三氯醋酸。
(7)焦宁G。
(8)水溶苯胺黑。
(9)甲基化乙醇。
(10)冰醋酸。
3．溶液(全部溶液均需用蒸馏水配制)
(1)25%2－氯乙醇中溶解焦宁G(或考马斯亮蓝R250或G250)，配成0．02%溶液，作样品提取液。
(2)乳酸铝贮存液(Ⅰ) 称取乳酸铝27．3g，吸出乳酸82ml(88%)，溶于500ml水中。
(3)乳酸铝缓冲液 吸取乳酸铝贮藏液20ml，称取尿素150g，溶于水中(5∶1)，将pH调节到3．1±0．05，每天配用新液。
(4)固定液 称取三氯醋酸40g溶解于200ml水中，配成20%浓度溶液。
(5)染色液 称取苯胺黑1g，醋酸200ml，工业甲基乙醇200ml，加水1700ml配成。
(6)脱色液 配制40%浓度工业甲基乙醇。
4．操作方法
(1)取样及样品数量 选取代表性样品。样品数量取决于所要求测定品种纯度的正确度。例如在混杂率30%样品种中，要求测定的概率为0．95时，只要测定8粒种子即可。在日常品种鉴定时，不会有这么高的混杂率。最通常的混杂率只有5%－10%，那么只要测定30－60粒即可。
(2)醇溶蛋白的提取 将单粒小麦种子包在纸里用鎯头敲碎或钳夹碎。分别单独移入微量板的小井里，每个小井加150μl提取液，并在室温下静置过夜。
(3)淀粉凝胶的制备 封好胶模架的底缝，用胶带将胶模架竖起将玻璃板(285×218×2mm)放在胶模架上。
按表11－3说明将淀粉加入缓冲液中，成悬浮液。另外容量的缓冲液加热至沸腾，然后加到上面的淀粉悬浮液里，用银质混合器将其混合均匀。然后立即倒入胶模架里，用两支玻棒将玻璃板向下压，直至除去所有的空气泡为止。
表11－3 配制1－6号淀粉凝胶所需淀粉和缓冲液数量
让凝胶在室温下冷却15分钟，然后移至4℃下15分钟。剥去凝胶架基部和边上的胶带，用不锈钢丝将凝胶表面刮平，除去多余的凝胶，并在其表面盖上胶片，以防干燥。
(4)电泳 每个缓冲槽加入300ml缓冲液，清洁凝胶用250V，每块胶板20mA，1．5小时。然后换上新缓冲液。拿去胶片，用样品梳模离相对一端20mm处，切出样品槽孔，用5×5mm，3号瓦特滤纸方片吸饱放在微型样品盆小井中的蛋白质提取液，插入凝胶上样品槽内。接通电源，加压至焦宁G指示剂显色线迁移17cm为止(4．5小时)。
(5)固定和染色 关好电源，用小刀从凝胶模架边上开始分开凝胶，抬起胶板，再放在另一块玻璃板(285×118×3mm)上的胶模架里。如前述，刮去胶板上的残留物，移放在三氯醋酸(20%100ml)中，淹没其表面，固定5分钟，然后浸入500ml染色液里，染色过夜。染色后再将胶板移入脱色液中2小时，以改善底色与蛋白谱带之间的反差。最后可进行观察鉴定。
【参考文献】：
〔1〕颜启传(1984)，杂交水稻及其三系种子的真实性和纯度检验，《种子》1984年第3期第15－18页。
〔2〕颜启传(1984)，应用聚丙烯酰胺凝胶酯酶同工酶垂直板电泳鉴定杂交水稻及其三系种子真实性和纯度，《浙江农业科学》，1984年第4期第196－199页。
〔3〕颜启传(1986)，水稻杂交种及其三系种子鉴定技术的进展，《种子世界》，1986年第8期，第2－3页。
〔4〕颜启传、黄亚军(1986)，杂交玉米吉单101及其亲本自交系种子真实性和纯度测定技术的研究，《种子》，1986年第5期，第12－15页。
〔5〕帅素云等(1983)，用酯酶同工酶分析法鉴定杂交水稻种子纯度，《江苏农业科学》，1983年第9期第16－20页。
〔6〕陆士伟等(1982)，应用酯酶同工酶测定水稻杂交纯度的研究，《中国农业科学》，(9)：10－15。
〔7〕汪德耀主编(1981)，细胞生物学实验指导，人民出版社，第377－385页。
〔8〕张龙翔等主编(1981)，生化实验方法和技术，人民教育出版社，第99－111页。
〔9〕上海植物生理学会编(1985)，植物生理学实验手册，上海科技出版社，第470－490页。
〔10〕美M．J．Siciliano等编(1980)，凝胶上酶的分离和显现，《植物生理学通讯》，第4期，第59－68页。
〔11〕南京大学生物系编(1979)，生物化学实验，人民教育出版社，第64－71页。
〔12〕胡能书、万贤国编(1985)，同工酶技术及其应用，湖南科学出版社。
〔13〕陆士伟、赖天斌编着(1987)，同工酶在农业上的应用，广东科技出版社。
〔14〕华家圣等(1979)，实用蛋白质化学技术，上海科技出版社。
〔15〕孙敬三等(1987)，植物细胞学研究方法，科学出版社。
〔16〕C．C．赖德等(1987)，同工酶，科学出版社。
〔17〕H．Stegemann et al(1985)，Gel Electrophoresis and Isoelectric Focusing，Institnt fur Biochemie，West Germany．
〔18〕S．R．Draper(1987)，Standard Reference for the Identification of Cultivars of wheat and Barley by Polyacrylamide Gel ElectrophOresis．Seed Sci．& Technol．15：431—434．
〔19〕A．C．DEDALE，el al(1982)，A Revised glasscation of wheat gliadin electropherograms，J．natn．Inst．agric．Bot．16：53—60．
〔20〕A．Clydesdale el al(1982)，A Standard method for the identification of wheat varieties by electrophorosis of their gliadins，J．natn．Inst．agric．Bot．16：16—66．
〔21〕Hans Doll et al(1981)，Preparation of Barley stora geprotein，Hordein，for AnalyticaI Sodium Dodecyl Sulfate—polyacry]amide gel electrophOresis．Analyrical Biochem ical，115：61—66．
〔22〕S．R．Draper et al(1984)，Biochemical Tests for Cultivar IdentificatiOil ISTA．
〔23〕B．J．Cardy et al(1984)，Identification of Soybeon Cultivars using isoenzyme electrophoresis，Seed Sci．& Technol．12：943—954．
〔24〕Arnoldl，Larsen(1966)，A distinction bet ween proteins of annual and perennial ryegrass seeds，Proc．Association official Seed Analysis．56：47—51．
〔25〕D．Blogg et al(1982)，Starch gel electrophoresis for Soybean Cullivar identification，Seed Sci．& Technol，10：19—24．
〔26〕H．J．Andersen(1982)，Isoenzyme character of 47 barley Cultivars and their application in Cultivar identification，Seed Sci．& Technol，10：405—415．
〔27〕T．J．Gilland(1982)，Evaluation of phosphogluccisenrase allaenzyme electrOphoresis for the identification and registration of Cultivars of Perenn i al ryegrass．Seed Sci．& Technol．10：415—430．
〔28〕M．B．German et al(1977)，Variety—Specific electro phoresis Variants of four Soybean enzyme．Crop Sei．，7：963—965．
〔29〕A．L．Iarson(1967)，Elcctrophoretic differences in Seed protein among varieties of Soybean，Crop Sci．7：311—313．
〔30〕B．A．Mardyle et al(1980)，Barley caltivars identification by electrophoretic analysis of hordein proteins．
I．Extraction and separation of hordein proteins and exeronmental-effects on the hordein electrophoregam，Can．J．plant Sci．，60：1343—1350．
〔31〕B．A．Marchyle．eL al(1981)，Barley Cnltivars identifi cation by electrophoretic analysis of hordein prote．ins．Calalogus of electrophoregam for mulae barley Cultivars，Can．Plant Sci．，61：859—870．
〔32〕C．A．Wilkinson，et al(1985)，Polyacrylamide gel electrophoresis for Cultivat identification in tobaco，Crop Sci．，25：971—974．
〔33〕J．F．Wikson et al(1972)，Electrophoretic identification of Agestis palustris and pea pransis CulLivars，Crop Sci．，12：833—834．
〔34〕C．W．Wrigley(1983)，Identification of Cereal varieties by gel electrophQresis of the grain Proteins．Advances in ScienOe and Technology．
〔35〕S．E．Gwrdiner(1986)，SDS polyacrylamide gel electrophoresis of grass Seed prote ins：A method for Cnltivar identification of pasture grass，ISTA 21 Congress，Ⅱ(99)．