影响成功的因素
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第101页（5554字）
外植体生存、繁殖和再生的能力由于品种繁多的缘故，也由于一些因素：如培养外植体的来源、外植体的历史、外植体的生理状态、内源激素的浓度和总的培养条件，即无机盐、糖类、光照和温度的影响而不同。在这一点上它能够提供可靠的指标。由于每种植物皆有一些特殊要求，离体培养条件下可以进行必要的检测，赏试和谬误是成功的最好途径。
(一)植物材料
1．大小 当使用很小的外植体时，叶原基的存在决定着外植体的发育能力。Kassanis和Varma(1967)发现，使用0．1mm长的马铃薯分生组织培养时，带叶原基的分生组织比不带叶原基的分生组织生长发育得更快。例如分割大黄茎尖时必须带有2—3个叶原基，少了茎尖是不能生长的。Huang和Millikan(1980)报道，在苹果人工培养微型嫁接研究中，当使用的生长锥顶端的半球形突起下面，取带有0、2、4和6轮叶原基时，分别有15%、65%、75%和90%的成功率。生长锥顶端缺乏发育能力大概是由于它依赖于下层叶和茎组织的激素所致。对于生长来说，更需要一个具有激素平衡的复杂培养基。外植体的大小决定了它在培养过程中能否存活，一般地说，大的外植体存活的可能性更大。例如，Dale(1977)报道，在8种草本植物分生组织培养中，存活率在种间有不同，存活率高的与培养时分生组织的大小及长度密切相关。在木薯中，Kartha和Gamborg(1975)用实验证明，只有在外植体超过0．2mm长度时，才能形成完整的植株，外植体比0．2mm短时，只能产生愈伤组织或根。
根据上述讨论，很明显应该选用大的外植体，例如用茎尖和芽代替微小的分生组织。然而，当外植体来自病毒感染的植株，病毒并已侵入到分生区域时，应该选用最小体积的分生组织。Stono(1963)发现，当切取麝香石竹的茎尖分生组织培养时，外植体小于0．2mm时未能生根；那些大于0．75mm的产生了植物体，但有病毒斑点；在0．2—0．5mm之间的经常产生无病毒植株。Mellor和Stace-Smith(1977)总是不取小于0．3mm长的马铃薯分生组织，因为它未能长根，同时也几乎不用大于0．7mm长的芽，因为它们易于感染。在大小相当窄的范围内生根能力很少差异。尽管例子很少，仍然有人用长的茎尖培养并在消除病毒方面获得成功的例子，如Vine和Jones(1969)用5mm长的蛇麻茎尖进行培养获得无病毒植株。
2．芽的位置 外植体一般都取自幼嫩枝条的顶端，取自基部的较少。人们已经发现幼嫩阶段对于枝条的再生最适合。Rocst和Bokelmann(1981)报道了麝香石竹切段的培养，顶端的和基部的枝条发育百分率分别是88．6%和69．8%。对于菊花分生组织培养，Hollings和Stone(1968)查明了来自顶芽的外植体的成活率为32%，而侧芽的为18%，可以推断顶芽比侧芽具有更强的生长发育潜力。Hasegawa(1979)观察到取自玫瑰顶端外植体培养，发育出的新枝的百分率，是基部外植体的几倍。所以，在大多数情况下，我们应优先利用顶部的外植体。但因每个新梢仅一个顶芽，所以研究者也用腋芽，并同样获得了较理想的结果。
3．季节 象所有的无性繁殖方法一样，分生组织、茎尖、芽的培养是受到从外植体取材季节的影响。Altman和Goren(1974)在试管中培养柠檬芽，进行萌发时间的研究，发现休眠和发育周期与田间自然条件下观察的相同。因为物种都有一个确定的休眠周期。在各物种休眠的终期去取材，从外植体上可能获得比较理想的结果。Mellor和Stace-Smith(1969)发现大多数马铃薯休眠中，恰在休眠后如春季和夏初切取分生组织培养比一年中其后阶段所取材料容易发根。当Tabachnik和Kester(1977)在10月底培养杏仁的休眠芽时，芽的基部形成一些硬的愈伤组织，芽尖黄萎，最后死亡；相反，当在12月底至1月取材，由于芽尖受到了低温处理打破了休眠，培养起来显得十分容易，取自元月的材料培养，新梢发育早、长得快。对微型嫁接的研究，Huang和Millikan(1980)发现，在3月和6月期间从田间取材的苹果分生组织培养成活率为60%。而6月至11月成活率逐渐下降到10%，整个冬季(12—2月)停止在10%的水平上。
对于分生组织、茎尖和芽的培养，正在旺盛生长的茎尖是最可取的，因为它们有一旺盛的生长能力和低的病毒浓度。Stone(1963)从早春和早秋生长旺盛期取材培养分生组织外植体中，发现了一个较好的麝香石竹幸存者，而取材于夏季和冬季的则次之。Poessel等人(1980)报道了对于离体微型嫁接而言，切取芽的时期是枝梢迅速生长期。否则，成活率很低。我们可以通过温室、实验室或者田间春季生长季节在消过毒的蛭石里培育灭菌的茎段、鳞茎、球茎或块茎，从而得到生长旺盛的枝条。
(二)表面消毒
是对于茎尖、芽或切段培养而言。我们通常先切取比要接种的外植体大的材料进行表面灭菌，接着在无菌箱内切去多余的部分达到接种的大小，然后接种到培养容器中。
NaClO3是最常用的表面消毒剂，它一般作为5—6%的市售漂白剂，例如Clorox或Javex。植物切段通常在10—15%的漂白剂溶液中(含NaClO30．5—0．75%)浸泡5—10min，药剂浓度和浸泡时间应根据需要而定。Kunisaki(1980)用10%Clorox浸泡材料45min，NaClO3超过1%，甚至达到10%的浓度也有报道。这样高的浓度可能会导致组织破坏及细胞死亡。值得注意的是苹果枝条用一般的表面灭菌会容易受到损害，经培养基上的短时期培养增强了抵抗能力。按照这一程序，表面灭菌将不损伤无菌的苹果茎尖，现在还不清楚这样一个简单的预培养，在其它植物因表面灭菌受到损害的敏感性是否有效。
为了提高可湿性，应该在灭菌液中加入少量(0．01—0．1%)的表面活化剂，如吐温20、吐温80、特波尔。为了减少在外植体表面所形成的气泡，在浸泡时可采用磁力搅拌，超声波振动或真空。在漂白剂浸泡前，植物材料切段通常在70—75%的酒精中快速浸泡5—30s，这个额外的步骤不仅能杀死材料表面的微生物，而且也具有表面活化剂的作用。为了保证外植体表面灭菌的效果，如蒜的小鳞茎或者白杨的芽通常在酒精速泡后，接着又进行短暂的火焰处理。
许多木本植物要进行彻底灭菌是极端困难的，特别是取材于田间的外植体。为了减少美洲擦木茎尖培养的污染率，早春季节在5年生树的芽上间隔一周喷一次混合液，该混合液由一种抗菌素和一种系统性的杀菌剂混合而成〔0．1%链霉素+0．1%苯菌灵(Benlate)〕，在第四次喷药后一周，可以采摘刚发芽的茎尖通过表面灭菌，并接种在试管内。尽管采用这种方法，美洲擦木茎尖污染率仍有95%，采用田间种植的番木瓜和栗属植物也得到相似的污染率。在木本植物方面，为了降低污染率，McCown作了下述介绍：
①如果可能，利用温室或人工气候室种植植物。
②利用正处于生长发育旺盛的新枝。材料在自然环境生长的时间越长，遭到污染的机会越多，所以问题也多。
③如果把2．5—5cm的切段经过材料表面消毒，并放置于一个底部盛有1cm深液体培养液的容器中，将可得到较好的效果。芽萌发所长出的新的生长部分将作下一步琼脂培养基上的材料。试管中的液体培养基绝不能混有琼脂，这样可以一定程度减少污染物的生长。
尽管通过这些灭菌，污染物仍然可能沾在某些材料上，这是完全可能的，因为某些内生性微生物在外植体的组织内慢慢生长或潜伏着，在连续的培养过程中，我们的肉眼也未必能观察出来，为了检查和根除这种污染性的培养，一些实验室在培养过程中的某些阶段加入酪蛋白的水解物、细菌营养肉汤、或酵母浸出液培养基中，以便加速污染体的生长，如果有的话，可使其生长到一个可见的水平。
(三)分割
分割一般在超净工作台或有紫外线装备的无菌箱内进行，在分割时用的体视显微镜和照明装置及工作台、接种箱的表面均用70%或75%的酒精消毒，经过表面灭菌的移植器及工具应放置在工作台、接种箱内一个方便的台架上。
用单面刀片进行茎尖、芽或切段外植体的切取，用镊子将外植体转移到培养容器内，刀片和镊子每用一次后应该进行酒精消毒灭菌，然后用无菌纸吸干或火焰烤干。
分生组织的切割，需要体视显微镜、照明装置以及解剖刀。大多数解剖镜上的聚光装置通常释放出较强的热量，为了防止灼伤，在解剖切割时，应尽可能地缩短分生组织在灯光下的照射时间，最理想的方法是采用日光灯或玻璃纤维照明装置。我们实验室切割分生组织采用皮下注射针头，针头被切断成不同的长度(2和3cm)，然后固定在手柄上。为了使每个针头在酒精、火焰上消毒后有足够的时间干燥和冷却，我们用多个针头交替使用。用短的针头分离叶子和叶原基。分割茎尖松散的植物顶端分生组织，一般不太困难；对于被牢牢包裹的某些原基，而又要分离出顶尖的植物种类要特别小心，避免伤害分生组织，当分割接近于顶尖时，用另外一个消毒针头切除一个原基，以防微生物从原基上转移到消过毒的顶端。在切取一个具有大量毛状物的原基时，这个预防措施显得更为重要，例如草莓。切取分生组织时需要用长的针头，同时期望切口平滑、干净。转移外植体到培养基的表面时，就用同一针头进行，不需要替换。
只要外植体不被埋在培养基里，放置在培养基表面的位置关系不大。为了使培养基的营养物质和常常是表面粗糙的外植体有个最大的接触面积，通常在琼脂表面加上一薄层灭过菌的蒸馏水，这个附加的液体层，也能促使新培养的外植体组织所释放的有毒代谢产物进行有效的扩散。
(四)培养基
早期分生组织培养，White培养基(1943)被广泛应用。以后，有很多改进，最明显的是N、P、K水平的提高，Ca水平的降低，以及高pH值，减少离子沉淀。至今还没有一个培养分生组织、茎尖、芽的通用的有价值的培养基。大多数所用的培养基起初来源于根的培养或者其它目的的培养基，对于分生组织、茎尖、芽的培养，就其营养物质成分的最适浓度，特别是微量元素至今还没有一个正确估价。在表4-1所列的培养基中，MS培养基是经过一些修改变化的，是用得最广泛最有效的培养基之一。培养基的生长调节剂及盐的浓度应随植物种类而加以变化，特别应注意在不同的培养阶段进行改变。
【参考文献】：
〔1〕Andesson，W．C．1980 Mass propagation by tissue culture： prineiples and practics．In： Preceedings Conference on Nursery Production of Fruit Plants Through Tissue Culture-Applications and Feasibility SEA，Agri．Res．Results，N．E．Series No．11，pp．1-1 USDA Beltsville．
〔2〕Kartha，K．K．1981 Meristem culture and cryopreservation-methods and application In： Plant Tissue Culture(T．A．Thorpe ed．)pp．181-211．
〔3〕Murashige，T．1974 Plant propagation through tissue cultures．Annu．Rev．Plant physiol．25∶135-166．
〔4〕Wang，P．J and Hu，C．Y．1980 Regeneration of virus-free plants through in vitro culture．In： Adyances in Biochemieal Enginn ering，Vol．18，Plant Cell Cultures I(A．Fiechter， edpp．61-99．Springer-verlag，Berlin，Heidelberg，New York．