枣椰树
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第668页（13385字）
枣椰树属棕榈科(Arecaceae)含有200余属2500余种。如枣(Phoenix dactylifera L．)，椰子(Cocos nucifera L．)和油棕(Elaesis quineensis Jacq．)是广泛栽培的果树作物产物。是木本单子叶植物。现今利用作为食糖、纤维、燃料、木材、建筑材料、观赏、蜡、药物、造纸、糖、酿酒、染料和植物油。
(一)组织培养技术改良棕榈树
棕榈遗传和育种适用胚培养以加速胚发芽，得以更快地评价其幼苗子代，也可用异种或异属杂种发芽，这在自然界不能生存。
组织培养技术可在无菌条件下研究棕榈病害病原菌与寄主关系。也是研究其形态建成和生理学的模式材料。用克隆的再生植株可进棕榈群体的理想的检测：生长调节剂效应和环境刺激对其生长影响。改变营养培养基成分和物理环境，可阐明其开花和吸枝的机理。
(二)研究进展
Cwtter与Wilson(1954)首次将离体可可胚生长在改进White培养基+CW。自后，胚培养广泛应用于可可、油棕、和枣榈。
表25-9汇综了1970年来棕榈组织培养研究。现已40种代表29属的外植体产生愈伤组织。初步鉴别出11种无性胚和胚状结构的启动。只有2种从无性胚形成独立生活的棕榈：油棕和枣榈。4种从离体胚培养发育成植株。只有油棕和枣榈从茎尖经发生不定根长成完整再生植株。
表25-9 乔木单子叶种的组织培养
由此可知棕榈的多种外植体曾产生愈伤组织。但是，一般仅有更接近分生组织外植体产生的愈伤组织，有形成无性胚能力。从合子胚、侧芽、茎尖、未成熟花序取得了胚胎发生的棕榈愈伤组织。其性质高度异质性，非同步发育胚围以非分裂附属组织。油棕早期体细胞胚在前胚期突出状态是梨形白球状结构，呈有明显的外形。这些无性胚与合子胚一样含有储藏蛋白质和脂质体。经伸长和分裂，变成极化和发芽。枣榈或从单细胞产生的分生组织簇，埋在愈伤组织内，分裂形成分生组织位点，当转移到低生长素培养基后，也极化。
有意义的，无性胚吸盘退化，对发育中胚状体不发生从培养基吸取营养作用。合子胚和无性胚胎发生的胚柄表现平行发育形成幼苗。椰子从体细胞组织产生的愈伤组织与油棕和枣榈的不同，是非胚胎发生的，由有规则排列的细胞组成，顶端是松散链。但是，最近报道从椰子离体胚产生胚胎发生愈伤组织。
棕榈胚培养，大都栽培种在第1周内启动发芽。胚增大，产生初生根系，培养4-8周后，出现第一叶。油棕胚培养发芽要较长时间。象无性胚一样，子叶吸盘退化，离体合子胚里，无胚乳。培养游离胚切段研究油棕发芽中游离胚部分的发育和早期器官发生和不同器官间互作。
枣榈游离茎尖和分生组织尖用以再培养在含0．54μM NAA营养培养基上，促进不定根产生。也曾启动若干格外腋芽。培养的芽增大，接种2周内，表现格外叶的发生。8周后，许多绿色光合叶占优势。带根枣榈尖移栽成功。
枣榈和油棕的完整未成熟花序芽和成熟与未成熟个体花离体培养建立。营养培养基加NAA，枣榈花序和单独花芽开花；有时雄花芽从明显退化假果皮伸出。离体培养的花芽，变绿、增大，形态建成，但仍保留它的短暂生命，很少见在培养中能生存几周或几月。
(三)培养成功的关键因子
棕榈组织培养必需满足：(1)外植体生存和生长所必需的基础营养，(2)外植体和培养基褐化最低。
1．培养基组成
(1)基础培养基成分 Eeuwens(1976)试验了WH，Heller′s，MS和Y3培养基，保持碳水化合物，有机成分和荷尔蒙附加物为常数，对叶柄、茎和花序的反应。MS和Y3无机盐类(高氮)愈伤组织生长最好。反之，NO3-N和NH4-N低的WH和Heller′s愈伤组织生长明显较差。碘加强体细胞椰子外植体愈伤组织产生。同样，Miniano与De Guzman(1978)发现椰子胚在WH液基加MgCl2或KCl生长较好。
若干学者采用改进WH盐类加CW，生长素和细胞分裂素离体培养椰子发芽。Schroeder(1970)用改进WH加IAA和KIN培养枣榈组织。Ammar与Benbadia(1977)用Knob培养基培养枣榈种子发芽。
MS+生长素(2，4-D或NAA)适于枣榈体细胞外植体组织取得愈伤组织。Heller′s+CW，2，4-D和KIN从油棕胚产生胚胎发生胚。Reynolds与Murashige(1979)，Tisse-rat(1979)用改进的MS+活性碳，增高生长素水平到0．05-0．5mM，产生了大量枣榈愈伤组织。Reuvani(1979)主张用
，NAA，KIN，IBA和2，4-D和活性碳，从离体多胚取得胚胎发生愈伤组织。
Tisserat(1979)报道碳水化合物源对离体枣榈茎尖生存的重要性。无论无机盐类，维生素和荷尔蒙如何，枣榈在3%蔗糖营养培养基上能生存和生长。但前者是离体培养完成分化所必需。
(2)复杂附加成分 5-20%CW促进椰子胚发芽(Abraham与Thomas 1962，等等)。Wang与Huang(1976)用培养基加15%CW，0．5%ME和0．05或0．3%活性碳，使Mascarena lagenicaulis L．，M．vershaffletii L．，和Caryata urens L．离体胚发芽。但是，枣榈胚发芽不需CW(Reuveni与Lilien-Kipnis，1969)。Tisserat用改进MS+0．3%活性碳不加荷尔蒙或CW几种棕榈种离体胚能以发芽。Hodel(1977)用简单规定培养基使Pritchardia Kaalae Rock和Veitchia joannis H．Wendl．离体胚发芽。椰子和油棕游离胚的充分发芽，需要特定培养基和处理。Fisher与Tsai(1978)发现椰子胚在改进液基MS加57．0μM IAA，98．0μM IBA，22．0μM BA，20%CW和12．5-25．0μM 2iP发芽最好，移至琼脂培养基促进生根。Robéchault等(1967，1968，1969)仔细研究油棕胚离体培养发芽和培养。除营养成分外，胚发芽受种子含水量，种子储藏时间大的影响，和种子休眠与含水量的关系。
营养培养基加CW，曾取得体细胞外植体产生愈伤组织。但在各种化学规定培养基不加任何复杂附加物，也曾取得棕榈外植体组织的滋生愈伤组织。
(3)其它培养基附加物 培养基加0．56mM肌醇和1．2μM盐酸硫胺素，加强各个棕榈种人工培养生长。枣榈茎尖也曾生长于更复杂维生素成分中，含泛酸钙(2．0μM)，烟酸(8．1μM)，盐酸吡哆醇(4．9μM)，生物素(0．04μM)和肌醇(0．56mM)。
毫无问题，产生愈伤组织的最关键营养成分是生长素。诱导棕榈体细胞组织产生愈伤组织的关键是生长素类型和浓度。当加活性碳时，生长素浓度必需加到极高水平，如0．15-0．5mM，以诱导形成愈伤组织。大都棕榈胚发芽不需要生长素和细胞分裂素。
(4)吸收剂 棕榈组织对外植体释放的致死性褐化物质尤为敏感。培养基加活性碳有益于克服褐化。曾用PVP、腺嘌呤、谷酰胺，和柠檬酸氨加入培养基，使褐化减到最低。抗坏血酸、3，4-二羟萘、二甲基亚砜，PVP无效。Smith与Thomas(1973)主张在培养期间切除褐化组织加以防止。Apavatjrut与Blake(1977)提出用营养平衡培养基可消除褐化。
2．外植体源 枣椰分生组织区域：合子胚、茎尖和叶丛侧芽是取得愈伤组织启动和生长的最好材料。其分生组织，花柱、叶柄、根和叶对具有胚胎发生潜势的愈伤组织价值不大。椰子、枣榈和油棕的合子胚也是此类的合式给源。还有未成熟和成熟枣榈胚。
胚发芽后，无论从幼苗和成年树取得的棕榈外植体的全能性，在产生愈伤组织和进行无性胚胎发生能力都下降。从发芽的枣榈胚子叶鞘产生了胚胎发生愈伤组织。枣榈茎和叶组织和椰子茎和花序取得愈伤组织。但未发育成无性胚胎发生结构。常只生根。Racéchault与Martin(1976)从幼叶产生愈伤组织。棕榈花序人工培养发育开花。枣榈分生组织活跃侧芽，带有预形成叶和茎尖培养经叶启动发育增大。反之，以不带叶为特征的非分生组织芽培养几周后很少生存。
3．污染问题 棕榈培养常在表面消毒接种后发生污染。曾用乙醇浸和火焰处理、氯氨-T，8-羟喹啉、过乙酸和氯化汞以及次氯酸钠溶液。最常用0．26-2．6%次氯酸钠加几滴乳化剂浸外植体15-30min，取出用无菌水淋几次。有时在接种前再用次氯酸钠浸5-10s，对茎尖和侧芽培养有利。无菌花序组织可从未开佛焰花序取得，不需表面消毒。
培养后几天、几周甚至几月从外植体内部出现污染。Fisher和Tsai(1978)和Smith与Thomas(1973)提出用抗生素加入培养基，但效果不好(Reuweni与Lilien-Kipnis1974)。
4．独立生活棕榈生产 棕榈种胚培养、胚胎发生愈伤组织再生植株和茎尖生根都取得了独立生活棕榈。Corley等(1976)报道油棕愈伤组织产生克隆再生株常见根系差。但改变培养光照条件可加强油棕再生株生根。枣榈愈伤组织再生株由于无不定根，根系也差。后者培养在琼脂营养培养基不加活性碳含0．005μM NAA促进不定根形成。枣榈和其它棕榈种再生株进一步生长不必要初生根系，应切短到长1-2cm，以利移植。叶大小和叶数是移栽入土的另一关键因子。枣榈再生株有2或3叶，芽长10cm以上，不定根系发育良好，长5-10cm，钵栽独立生长成活率100%。Corley(1976)注意到叶上喷抗蒸腾剂和部分去叶，有助于油棕再生株移栽大田成功。
5．质量控制试验 估价组织培养再生植株无性系性质最好方法是取成长植株与亲本系比较其营养和结果特性。常见的变异包括染色体得或失、基因突变或其组合。棕榈幼苗群体单克隆产生的组织培养再生植株结实变异少。同样取得了结实油棕再生株。
油棕初步染色体分析(2n=32)，证实了无性再生植株与亲本系相同。Tisserat(1981)发现二个组织培养物中和它的亲本系7基因酶系统的同工酶变异。根据营养体特性和宏观形态与生化反常性选择棕榈，可在生长至成株期间淘汰畸变植株。
(四)培养程序
棕榈组织培养研究可归成3类：(1)加速繁殖，(2)胚培养和(3)生长与发育生理研究。加速繁殖可经无性胚胎发生，即无性胚启动与发芽形成再生植株；或经器官发生，即培养的组织或器官顺序形成根和芽。棕榈可由此得到大量遗传一致植株。胚培养是离体胚的切取和发芽，可用于保存罕见杂交，或自然界不能得到的幼苗。组织培养为了解其生长、形态建成和生理过程提供途径。棕榈科大而多样，但人工培养反应相当一致。Tisserat曾采用枣榈培养基和技术，能以取得许多棕榈种离体胚的愈伤组织和、或发芽。
1．棕榈胚发芽
(1)种子浸水24-43h，胚吸水和便于种子开裂。
(2)种子浸入2．6%次氯酸钠溶液(每100ml加一滴吐温20)约15-20min；排去灭菌溶液，种子放进15×150mm培养皿。在超净台进行。
(3)用长7．5英寸镊子选取种子，供取胚用。在种沟对立端纵切2cm，使胚暴露，不受损伤。
(4)从半粒种子用外科手术刀切取暴露的胚。(a)从吸盘末端切取胚(即埋在种子内最深处)，或(b)用刀片盾面从胚乳-胚腔压出胚。
(5)离体胚轻放在琼脂培养基表面上。不要损伤胚和埋进琼脂培养基。
(6)接种在胚发芽培养基上，培养在28℃光强50fc(Gro-lx荧光)。
(7)接种后1-2周，胚开始增大和发育。8周后再生植株长2-6cm，有初生根系和第一叶。此时应变更胚的位置，使根埋进琼脂培养基，叶向上生长。
(8)把初生根切短长1-2cm，重培养在不定根形成培养基上，以加强不定根形成。每隔8周继代一次，2或3次，直至幼苗长10cm，2-3叶和滋生的不定根系。
(9)仔细移栽再生株使之独立生活。从培养基移出时不伤根系，浸入蒸馏水15min，以防失水和除去剩留培养基。用蒸馏水淋再生株3次，喷0．5%benolate杀菌剂，移入土培养基。土培养基是无菌泥炭∶
石1∶1(v／v)。装钵备用。放置塑料篷中。
(10)每周喷叶(0．5%benolate)一次，使菌生长减至最少。在最初二个月期间，隔天浇蒸馏水，每周施
Hoagland溶液。植株生长在28℃，800fc，16h光周期生长箱内，2周。移置遮荫温室。在塑料蓬上钻孔逐步驯化再生株。2月后，可除去遮蓬，作为幼苗管理。
2．胚愈伤组织再生植株
(1)合子胚的处置与培养同胚发芽培养程序(1)-(5)。
(2)胚培养在愈伤组织产生培养基(表25-10)28℃暗培。
表25-10 各种棕榈培养基成分
(3)每隔8周重培养外植体一次转移。2-3次后出现愈伤组织启动。
(4)当出现明显松脆、白色、颗粒状愈伤组织时，取1－cm2小块继代到胚发芽培养基(表25-10)，28℃，16h光周期，光强50fc。2-4周出现无性胚和绿色再生植株。
(5)采用胚发芽原生克隆7-10节取得独立生活再生植株。
3．茎尖和侧芽愈伤组织取得再生植株
(1)用斧与锯刀切枝梗或树。向顶地去叶，直到露出每叶轴心的侧芽。老叶剥除后取芽端的茎尖。储藏芽，蘸冷抗氧剂溶液(0．73mM柠橼酸和0．57mM抗坏血酸)。外植体保存在0℃冰箱，直到表面消毒用。
(2)修整最外层叶和尖，取得0．5cm2外植体。
(3)用纱布包裹外植体以防损失，放进25×150mm培养管消毒。用2．6%次氯酸钠溶液(每100ml加一滴吞温-20)消毒15分钟。定期摇动试管，去除组织上气泡。倒去漂白粉溶液，无菌水淋洗3次。取外植体无菌接种在无菌培养皿(直径15×150mm)中。
(4)除去茎尖格外叶，取1-3mm2外植体芽接种。蘸漂白粉溶液10秒钟，接种前降低污染。
(5)接种在愈伤组织产生琼脂培养基上(表25-10)。
(6)采用本原生克隆3-5节，从胚愈伤组织取得再生植株，通过愈伤组织取得再生植株。
4．茎尖生根繁殖棕榈
(1)重复上述1-4节从茎尖和侧芽愈伤组织取得再生植株。
(2)接种外植体在茎尖培养基(表25-10)表面。
(3)培养在25℃，16h光周期，光强50fc环境控制箱里。
(4)培养4-6周内，培养体出现叶和相当增大。每8周继代外植体到新鲜培养基一次。
(5)采用棕榈胚发芽原生克隆8-10节，使芽和尖生根，取得独立生活棕榈。
(五)展望
由此缺乏成批无性系技术，妨碍了棕榈的开发。目前，许多采集野生资源利用，设法种植可生产大量有用产物。对此组织培养技术能提供答案。Tisserat认为忽视了了解其生长，生理、生化知识。人工培养技术能加以仔细研究，以助更有效地利用。目前，油棕组织培养繁殖已接近商业生产。需研究改进培养技术，供商业采用，开发质量控制试验，以证明愈伤组织产生再生植株的克隆性质。棕榈组织培养应着重于(a)采用集团系系统从愈伤组织大量生产棕榈，和(b)探明离体培养侧芽和茎尖分裂和生根机理。
棕榈组织培养可用作其它研究手段。微繁殖结合深冻储藏以保存垂危资源，供将来育种选种研究用。初步研究指出枣榈愈伤组织可低温储存。遗传工程如原生体融合和花药培养可加速棕榈育种研究。
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