食品中黄曲霉毒素B1的测定——薄层层析法(GB／T 5009．22—1996)
出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《焙烤工业实用手册》第619页（6883字）
1．原理
样品中黄曲霉毒素B1经提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。
本法在薄层板上黄曲霉毒素B1的最低检出量为0．0004μg，最低检出浓度为5μg／kg。
2．试剂
(1)三氯甲烷。
(2)正己烷或石油醚(沸程30～60℃或60～90℃)。
(3)甲醇。
(4)苯。
(5)乙腈。
(6)无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水。
(7)丙酮。
以上试剂在试验时先进行一次试剂空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。
(8)硅胶G：薄层色谱用。
(9)三氟乙酸。
(10)无水硫酸钠。
(11)氯化钠。
(12)苯－乙腈混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混匀。
(13)甲醇水溶液：55∶45。
(14)黄曲霉毒素B1标准溶液。
①仪器校正：测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素。准确称取25mg经干燥的重铬酸钾(基准级)，用硫酸∶水=0．5∶1000的硫酸溶解后并准确稀释至200mL，相当于ck2cr2o7=0．0004mol／L。再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中，加硫酸∶水=0．5∶1000溶液稀释至刻度，相当于0．0002mol／L溶液。再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中，加硫酸∶水=0．5∶1000溶液稀释至刻度，相当于0．0001mol／L溶液。用1cm石英杯，在最大吸收峰的波长(接近350nm处)用硫酸∶水=1∶1000的溶液作空白，测得以上3种不同摩尔浓度溶液的吸光度，并按下式计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。
式中 E1——重铬酸钾溶液的摩尔消光系数；
A——测得重铬酸钾溶液的吸光度；
c——重铬酸钾溶液的摩尔浓度。
再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值3160比较，即求出使用仪器的校正因素。
式中 f——使用仪器的校正因素；
E——测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。
若f大于0．95或小于1．05，则使用仪器的校正因素可略而不计。
②黄曲霉毒素B1标准溶液的制备：准确称取1～1．2mg黄曲霉素B1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光，置于4℃冰箱保存。该标准溶液约为10μg／mL。用紫外分光光度计测此标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值。计算：
式中 x1——黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度(μg／mL)；
A——测得的吸光度值；
f——使用仪器的校正因素；
M——黄曲霉毒素B1的相对分子质量312；
E2——黄曲霉毒素B1在苯－乙腈混合液中的摩尔消光系数，19800。
根据计算，用苯－乙腈混合液调到标准溶液浓度恰为10．0μg／mL，并用分光光度计核对其浓度。
③纯度的测定：取5μL 10μg／mL黄曲霉毒素B1标准溶液，滴加于涂层厚度0．25mm的硅胶G薄层板上，用甲醇∶三氯甲烷(4∶96)与丙酮∶三氯甲烷(8∶92)展开剂展开，在紫外光灯下观察荧光的产生，必须符合以下条件：
在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点；原点上没有任何残留的荧光物质。
(15)黄曲霉毒素B1标准使用液：准确吸取1mL标准溶液(10μg／mL)于10mL容量瓶中，加苯－乙腈混合液至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于1．0μg黄曲霉毒素B1。吸取1．0mL此稀释液，置于5mL容量瓶中，加苯－乙腈混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0．2μg黄曲霉毒素B1，再吸取黄曲霉毒素B1标准溶液(0．2μg／mL)1．0mL置于5mL容量瓶中，加苯－乙腈混合液稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0．04μg黄曲霉毒素B1。
(16)次氯酸钠溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·10H2O)溶于500mL温水中，再将两液混合、搅拌，澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为25g／L。若用漂白粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的浓度约为50g／L。污染的玻璃仪器用10g／L次氯酸钠溶液浸泡0．5d或用50g／L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。
3．仪器
(1)小型粉碎机。
(2)样筛。
(3)电动振荡器。
(4)全玻璃浓缩器。
(5)玻璃板：5cm×20cm。
(6)薄层板涂布器。
(7)展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm。
(8)紫外光灯：100～125W，带有365nm滤光片。
(9)微量注射器或血色素吸管。
4．分析步骤
(1)取样。样品中污染黄曲霉毒素高的霉粒一粒可以左右测定结果，而且有毒霉粒的比例小，同时分布不均匀。为避免取样带来的误差，必须大量取样，并将该大量样品粉碎，混合均匀，才有可能得到确能代表一批样品的相对可靠的结果，因此采样必须注意以下几点：
根据规定采取有代表性样品。
对局部发霉变质的样品检验时，应单独取样。
每份分析测定用的样品应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至0．5～1kg，然后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，混匀。花生样品全部通过10目筛，混匀。或将好、坏分别测定，再计算其含量。花生油和花生酱等样品不需要制备，但取样时搅拌均匀。必要时，每批样品可采取3份大样作样品制备及分析测定用，以观察所采样品是否具有一定的代表性。
(2)提取。
①玉米、大米、麦类、面粉等。称取20．00g粉碎过筛样品(面粉不需要粉碎)，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL，正己烷或石油醚和100mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20．00mL甲醇水溶液(相当于4g样品)置于另一125mL分液漏斗中加20mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜，于65℃水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却2～3min后，准确加入1mL苯－乙腈混合液(或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后，准确加入1mL苯－乙腈混合液)。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。
②花生油、香油、菜油等。称取4．00g样品置于小烧杯中，用20mL正己烷或石油醚将样品移于125mL分液漏斗中。用20mL甲醇水溶液分次洗烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇2min，静置分层后，将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并移入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，以下按4(2)①自“振摇2min，静置分层”起，依法操作。
(3)测定。
①薄层板的制备：称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量2～3倍的水，用力研磨1～2min至成糊状后立即倒于涂布器内，推成5cm×20cm，厚度约0．25mm的薄层板3块。在空气中干燥约15min后，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置时间较长，可再活化后使用。
②点样：将薄层板的边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为1cm，点直径约3mm。在同一板上滴加的点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：
第一点：10μL黄曲霉毒素B1标准使用液(0．04μg／mL)。
第二点：20μL样液。
第三点：20μL样液+10μL 0．04μg／mL黄曲霉毒素B1标准使用液。
第四点：20μL样液+10μL 0．2μg／mL黄曲霉毒素B1标准使用液。
③展开与观察：在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮∶三氯甲烷(8∶92)，展开10～12cm取出，在紫外光下观察结果，方法如下。
由于样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准使用液，可使黄曲霉毒素B1标准点与样液中的黄曲霉毒素B1荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B1为0．0004μg，可用做检查在样液内黄曲霉毒素B1最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中的黄曲霉毒素B1为0．002μg，主要起定位作用。
若第二点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B1含量在5μg／kg以下；如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。
④确证试验：为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉毒素B1的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在0．1。于薄层板左边依次滴加两个点。
第一点：10μL0．04μg／mL黄曲霉毒素B1标准使用液。
第二点：20μL样液。
于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min后，使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃。再于薄层板上滴加以下两个点。
第三点：10μL 0．04μg／mL黄曲霉毒素B1标准使用液。
第四点：20μL样液。
再展开同4(3)③，在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。
⑤稀释定量：样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量(0．0004μg)的荧光强度一致，则样品中黄曲霉毒素B1含量为5μg／kg。如样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下：
第一点：10μL黄曲霉毒素B1标准使用液(0．04μg／mL)。
第二点：根据情况滴加10μL样液。
第三点：根据情况滴加15μL样液。
第四点：根据情况滴加20μL样液。
5．计算
式中 x2——样品中黄曲霉毒素B1的含量(μg／kg)；
V1——加入苯－乙腈混合液的体积(mL)；
V2——出现最低荧光时滴加样液的体积(mL)；
D——样液的总稀释倍数；
m1——加入苯－乙腈混合液溶解时相当样品的质量(g)；
0．0004——黄曲霉毒素B1的最低检出量(μg)。
6．结果的表述
报告测定值的整数位。
7．注意事项
(1)测黄曲霉毒素的检样，应该特别注意代表性，每份平均样品至少1～2kg，全部粉碎并全部通过1．5～2．0mm筛孔，对局部发霉样品，要单独取样，单独检验。
(2)黄曲霉毒素B1标准液的保存方法：将标准液保存于具塞试管中，将塞密闭并封严，避光，贮于4℃冰箱。用后在标准液的液面处做记号，用前检查标准液在贮藏期的体积有否改变，若有明显的减少，则应准确滴定补充溶剂到记号处后再用，因此管径愈细，则滴加到记号处的误差愈小；此外5～10μg／mL的黄曲霉毒素B1标准液也可以定期再用紫外分光光度计测定其浓度，以及做薄层色谱的纯度测定。以检查其浓度与纯度有否改变。
(3)实验结束后，受污染的玻璃仪器，经5%的次氯酸钠浸泡5min后，再用水冲洗，不要浸泡时间太长，以免玻璃变得不透明。