厌氧菌的鉴定总则

出处：按学科分类—医药、卫生中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第16页（7672字）

厌氧菌的鉴定与其他细菌的鉴定一样，系统的鉴定包括：①表型鉴定(形态、生化性状)；②细胞壁组分鉴定；③蛋白质水平鉴定；④基因组水平鉴定。目前国内外的厌氧菌鉴定标准主要依据《Bergey’s系统细菌学手册》(1卷、2卷)所检索的厌氧菌鉴定特性，包括各种厌氧菌的形态学、生理生化特性及代谢产物分析、DNA的G+C含量等。但对大多数临床厌氧菌的鉴定则要求简便快速，所以Finegold的临床厌氧菌三级鉴定对中小实验室尤为实用，下面将介绍有关内容。

据Finegold标准拟定国内临床厌氧菌三级鉴定主要内容，供国内厌氧菌检验时使用。

一级鉴定：一级鉴定又称初级鉴定，主要根据耐氧试验、选择性培养基，标本的来源和细菌的菌落、菌细胞特征报告厌菌检出结果，鉴定到类群或属(种)。此即为初代培养结果观察。

二级鉴定：在一级鉴定的基础上，进一步结合细菌的生长特性、生化试验结果等，将厌氧菌鉴定到属或种，或者为初代培养物，经纯化、需氧对照为厌氧菌株，简单的几个酶测定的综合结果。

三级鉴定：在一级和二级鉴定的基础上，补充系统生化试验结果或进一步做代谢酸产物分析，DNA的G+Cmol%含量测定，鉴定标准参照《伯杰氏系统细菌鉴定手册》。

(一)初代分离

标本经肉眼观察直接涂片后应接种固体和液体两种培养基(作贮存使用)，以增加分离率。

1．培养基的使用 ①最好使用新鲜培养基，2～4小时内用完；②可使用预还原培养基，预还原24～48小时最好；③可采用预还原厌氧菌法(prereduced anaerobic sterilized)，即PRAS配制培养基；④液体培养基应煮沸10分钟，驱氧后立即冷却使用；⑤厌氧菌的培养基多为营养丰富的培养基，并加有还原剂如L－半胱氨酸或硫乙醇酸盐，以降低培养基的Eh(氧化还原电势)。有利于厌氧菌生长，还加有生长刺激因子如血清、维生素K₁，氯化血红素、吐温－80、瘤胃液、乳酸盐、富马酸等。

2．培养基的选择初代培养时一般都必须使用选择性培养基和非选择性培养基。

(1)非选择性培养基：使所分离的厌氧菌不受抑制，以免漏检。常使用心脑浸液琼脂(BHI)、布氏琼脂(BR)、胰豆胨肝粉琼脂(GAM)、胰胨酵母琼脂(EG)、CDC琼脂等。

(2)选择性培养基：有目的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧菌种类。常使用的有KV血平板(即上述非选择性培养基中加卡那霉素和万古霉素，KV冻溶血平板(即上述培养基加血低于－20℃冰箱中5～10分钟)；七叶苷胆汁平板(BBE)对脆弱类杆菌群有较好的选择作用；FS培养基(梭杆菌选择培养基)；ES培养基(优杆菌选择培养基)BS培养基(双歧杆菌选择性培养基)、卵黄(EYA)及兔血平板(RBA)(用于选择产气荚膜梭菌)；VS培养基(韦荣氏球菌)；CCFA培养基(难辨梭菌选择培养基)等。

3．怎样选择

(1)根据标本直接涂片结果，标本中以革兰氏阴性杆菌为主，宜选择类杆菌或梭杆菌选择性培养基。

(2)根据标本的来源进行选择。如来自口腔及其附近标本的宜用KV冻溶血平板；FS血平板或VS血平板，又如来自腹腔标本选用BBE、EYA及RAB和PS琼脂(消化链球菌选择培养基)

(3)标本的肉眼观察和闻气味亦可作为选择培养基考虑。①如感染部位产气、脓肿、坏死，可能为产气荚膜梭菌引起，而少量产气多为消化链球菌和类杆菌感染。②病人长期使用氨基甙类抗生素，病灶有恶臭和陈旧性分泌物多为脆弱类杆菌的混合感染。③感染大部分泌物有黄色硫磺样颗粒多为放线菌感染；分泌物为黑色有恶臭，在紫外线灯照射下有荧光多为产黑色素普氏菌感染。④常规血培养阴性的心内膜炎。宜用厌氧培养，多为消化链球菌类杆菌、丙酸杆菌、梭菌或梭杆菌感染；又如来自白血病的血标本，多为脆弱类杆菌感染，有时也分离到产气荚膜梭菌等，这些都有利于我们选择培养基。

一般来说临床多用2块选择性血平板，1块非选择性血平板，有时增加1管液体培养基做初代培养。

4．培养方法厌氧培养方法很多，仅介绍常用的几种技术。

(1)亨格特(Hungate)的转动划线管法：这种方法使分离和培养一次完成，以预还原厌氧消毒培养基(PRAS)管四壁，划线接种于充有混合气体的管内壁，用丁烯胶塞塞紧后置普通培养箱中培养。缺点是：需特殊的接种设置。

(2)Gas-Pak罐法：接种平板置罐内后，将烘烤钯粒盘装于盖底，加入产气袋(并剪角)，放入美蓝指示条，在产气袋中加入10ml水，立即紧闭Gas-Pak罐。

此法优点是设施简单，操作容易，效果也不错，适合广大临床检验工作中使用。缺点是分离和接种都暴露在空气中进行，可能会抑制部分厌氧菌生长，尤其是对氧极敏感的厌氧菌。

(3)我们的部分工作经验简介：

Ⅰ．自制产气袋：用2支10～15cm(中)试管，一支盛硼氢钠(NaBH₄)0．8～1．0g，另一支盛柠檬酸1g和碳酸氢钠1．2g。试管稍用些脱脂棉盖住，用前配制为妥。

Ⅱ．自制美蓝指示管：

①6%葡萄糖溶液；1N氢氧化钠6ml，稀释至100ml；0．5%亚甲蓝溶液3ml稀释至100ml，三种溶液等量均匀混合，按每管1～2ml加于安瓶管中，加热至无色封管，其中氢氧化钠可用1N碳酸氢钠取代。

我们使用6%葡萄糖、1N碳酸氢钠、0．05%亚甲蓝溶液，20∶1∶0．5配制法。我们还使用60%羟甲基氨基甲酯(Tris Aminomethone)、4%葡萄糖溶液和0．02%美蓝溶液等量混合，装于试管、安瓿管或棉纸浸泡，铝箔真空封装。

②半固体美蓝指示剂：硼砂(即硼酸二钠625mg、硫乙醇酸钠600mg、美蓝6．25mg、酚红0．25mg，加蒸馏水150ml，用1NaOH调至pH3．0，加琼脂1．0～1．6g，加热混匀，并分装安瓿管溶封。

Ⅲ．钯粒在使用前1小时用220℃烘烤。

2H₂+O₂2H₂O

厌氧罐培养前先将一切实验准备工作做好，标本在30分钟内处理毕。

一般初化培养时间为48小时，少数标本厌氧菌生长不佳，可烤钯粒、换产气袋和指标剂后重新封罐，72小时培养后再开罐。

(4)抽气换气法：此方法使用干燥玻罐，上接三通管，平板置罐内后用真空泵抽气3次，前2次换气使用99．99%的高纯氮气，最后一次使用80%N₂、10%H₂、10%CO₂置换罐内气体并置厌氧指示剂和钢丝绒硫酸铜浸泡物。此法效果尚好，只是培养时间宜3～6天为宜。

(5)厌氧手套箱法：其原理类似Gas-Pak罐，一般医院无此类设施，不做详细介绍。其优点是整个分离培养过程都在厌氧环境中进行，效果较好；缺点是设施费用太高。

5．初代培养的结果观察(即一级鉴定)

(1)在BBE血平板上出现黑色中等菌(D＞1mm)、圆形、凸起、边缘整齐、菌落周围有灰黑色沉淀者；或KV血平板上有灰白、半透明中(小D＞0．5mm)菌落、圆形、边缘齐、镜检为G^-b(革兰氏阴性杆菌，下同)多型态，有的菌体可见空泡者——初级鉴定为脆弱类杆菌生长。

(2)在KV冻溶血平板上出现灰黄色、棕色、圆形、边齐、中小菌落(D为0．5～1．5mm)，置366nm紫外灯下有红色荧光者，镜检为G^－b者，一级鉴定为产黑色素普氏杆菌。

(3)在GAM或EG血平板上出现双圈溶血，卵黄平板上菌落周围有不透明区，聂格尔试验阳性，镜检为G⁺大杆菌，一级鉴定为产气荚膜梭菌。

(4)在KV血平板或GAM血平板上，菌落凹陷至琼脂内，镜检为G^-b者，一级鉴定为解脲类杆菌或纤维类杆菌。

(5)在FS或GAM血平板上，出现菌落表面有小斑点，如面包屑状，边不整，灰白色，不透明菌落，镜检为G^－b，梭杆菌体中有G⁺颗粒，一级鉴定为具核梭杆菌。

(6)在VS或GAM血平板上，出现细小(D＜0．3mm)不透明的菌落，镜检为G^－b小球菌，成双或成堆，少数可呈短链状，初级鉴定为小韦荣氏球菌。

(7)在硫酸镉琼脂上生长或GAM血平板上出现光滑、低凹或粗糙、不规则、含黄色颗粒，BHI血平板上出现“蜘蛛”状菌落，镜检为G+b有的长如树枝状，初级鉴定为放线菌。

(8)在LBS血平板上出现白色、圆形、边齐的中小菌落(1～2mm)，镜检为G⁺b，一级鉴定为乳杆菌。从TPY或LBS上灰黄或灰白、凸起、中小菌，革兰氏染色阳性，菌端有分叉，或排列成栅栏状，初步鉴定为双歧杆菌。

(9)在GAM或TATAC血平板上出现凸起、灰或白色、有光泽、圆形、边齐、中小(0．5～1．5mm)菌落，可有或无溶血，镜检为G⁺c(革兰氏阳性球菌)成双、单个或短链状，一级鉴定为消化链球菌。

(10)在GAM或MRS血平板上出现白色，凸起、边不整菌落(D为1～3mm)，镜检为G⁺b，多呈棒或网球拍状，一级鉴定为丙酸杆菌。

以上为一级鉴定的参考材料，药敏可同时做，48小时可初报药敏结果，供临床参考。

(二)次代和纯化培养

次代和纯化培养是二级鉴定，需氧对照和为三级鉴定准备的过程，此过程要点如下：

(1)全过程都使用非选择性培养基GAM、EG、CDC、BHI血平板，择一匀可。

(2)进行次代培养，原则上一个特征性菌落宜传3块平板，即一块置厌氧培养，一块置微需氧(CO₂)中培养，一块置需氧培养以防漏掉微需氧条件致病菌。但临床检验中一般只做需氧对照和厌氧培养2块平板。需氧培养不生长而仅厌氧培养生长的为厌氧菌，需氧对照原则上应做2～3次，厌氧培养时间一般为48小时，菌落太小，可进行液体培养增菌。

(3)在需氧对照和纯化培养过程中，注意观察菌落形态、溶血性、色素产生、荧光和凹痕产生，并可进行拉丝试验、革兰氏染色、荚膜染色、芽孢染色、鞭毛染色，观察染色情况和菌的形态。

(4)在纯化培养过程中还应进行胆汁耐性、抗生素敏感性(纸片法)、酶实验(触酶和卵磷脂酶)。

(5)二级鉴定结果判定如表1－6。

表1－6 临床厌氧菌二级鉴定表二级鉴定表

厌氧菌菌种的鉴定应包括生物特性(培养、菌落、菌体和染色、动力等)、生化性状检查、耐性(或抵抗性)、免疫学特征、代谢产物的气相色谱分析(GLC)结果、DNA中G+C mo1%、DNA同源性测定等。但在临床检验室，主要完成生物学特征、耐性和生化性状的检验，基本上可以鉴定临床常见的大部分菌种。其他鉴定技术如GLC，一般对G^-b中梭杆菌与类杆菌用其他方法难区别时可行GLC分析，此外一些G⁺b也需GLC分析，这在大多数临床检验室都无法完成的，可与有关研究单位合作解决。

生化性状检查方法很多，国外有APi系统、Minitek系统、RapID系统等等。国内有微管法、微板法以及根据笔者发明进一步商品化的XZF20A或10A生化条。

(三)临床检验(即第三级鉴定)

1．菌株来自选择性培养基的判断方法

(1)来自BBE血平板或KV血平板，以及冻溶血平板类杆菌和普氏菌菌株分为四大群：①G^-b对20%胆汁不敏感反而刺激生长(表1－7)；②G^-b对20%胆汁敏感生长差或几乎不生长(表1－8)；③G^-b有荧光的菌株或产生黑色素菌株(表1－9)；④来自口腔标本，有黑色素产生的卟啉单孢菌属三级鉴定表(表1－10)。

表1－7 革兰氏阴性厌氧杆菌胆汁不敏感株鉴定