麻风杆菌的培养与鉴定
出处：按学科分类—医药、卫生 科学普及出版社《麻风病实验室工作手册》第18页（4657字）
麻风杆菌体外人工培养开展至今已有百余年的历史，从60年代到80年代初虽有很多培养成功的报告，但均未能通过11届国际麻风会议拟定的鉴定标准。近年来鼠麻风杆菌在细胞内和无细胞培养基内先后培养成功，提示了在总结已往经验的基础上人ML的培养亦可望获得成功。
一、麻风杆菌的培养
(一)麻风杆菌的无细胞培养
所谓无细胞培养是相对于细胞培养即组织培养而言。就是在所配制的培养基中不含有细胞、器官和组织。但实际上绝对严格的界限是没有的。
无细胞培养法的主要优点是操作简单，易于观察，可以得到需要量的纯培养用于研究ML的结构、代谢、抗原分析、菌苗制备以及传染途径等。国内外学者多采用此法进行研究，其中较系统的为：
1．Skinsnes等人的含透明质酸的液体培养基 主要内容为0．066M的pH为6．24的磷酸盐缓冲液、甘油、透明质酸、酵母提取物和牛血清蛋白V部，分离出6株暗处产色菌，曾认为是ML。Kato声称重复试验得到与之相同的结果，并宣称创制一种含有脐带消化液的简化透明质酸培养基更好。但以后未见到类似的重复报告，尤其是Skinsnes的代表菌株HI－75株，经培养特性、鼠足垫接种、胞壁构架分析、皮肤试验及生化试验等鉴定之后认为属于瘰疬分枝杆菌(M．scrofulaceum)属，与ML无关。据间接与直接免疫荧光试验和辣根氧化酶标记荧光试验结果，Skinsnes坚持认为是ML，并通过犰狳接种试验提出透明质酸对ML有修补胞壁“漏洞”的作用，重申了再次看到ML的细胞外生长现象。
2．Chatterjee的BBL固体培养基 主要成分为Tryticase Soy琼脂肉汤补加0．1%琼脂和0．3%酵母浸膏而成。该氏报告所得菌株对小鼠有毒力，DOPA氧化酶测定为阳性反应。在培养过程中发现培养菌有一个没有抗酸性的球菌前身阶段，当培养成熟时能变成有很强抗酸性的杆菌。作者认为这种无抗酸性的球菌样前身是ML的可培养阶段。所获得的这些现象与Skinsnes、Kato等人的报告有相似之处。
3．曹－吴二氏等的京4培养基 主要成分是磷酸盐缓冲盐水、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、大鼠神经匀浆和鸡卵清蛋白。用此基分离出23株抗酸菌，生化特性基本一致，对已知抗麻风药物敏感，鼠足垫接种能生存，有的菌株引起鼠垫肿胀，甚至坏死，初步分类认为不同于已知的分枝杆菌。用抗酚糖脂－1(PGL－1)单克隆抗体进行鉴定试验，发现有2／3株与PGL－1呈相同的反应。对此，值得进一步研究证实。
(二)麻风杆菌的细胞(组织)培养
细胞(组织)培养就是将生物体内的一部分组织在体外培养、使其能在人工控制的条件下生长繁殖的一种技术。大体上说，组织培养方法包括组织块培养和分散细胞培养两大类。组织块培养方法又分为悬滴培养、液体悬浮培养和转管培养等法。分散细胞培养包括胰酶消化单层细胞培养、单个细胞悬浮培养(即深层培养)、细胞株的建立及传代培养以及琼脂平板法(包括单层及混悬法)等。近年来，由于制造疫苗和生化制剂以及研究病毒和细胞生化功能的需要，又发展了多表面培养和微载体培养等新方法，但其基本原理与分散细胞培养相同。
采用细胞培养法进行麻风杆菌培养研究的有：
1．松尾等从1970年以来声称用小鼠足垫细胞接种鼠ML获得成功，并作了培养ML的尝试。
作者将含有108ML的菌悬液接种于数个50毫升培养瓶的单层足垫细胞中，于25℃、33℃和37℃条件下培养72和96小时。发现33℃培养72小时是鼠足垫细胞吞噬ML的适宜条件。
2．Jadin等人将ML接种于淋巴细胞中，在37℃培养4天，见到细胞中有典型的ML菌球，在130份淋巴穿刺标本中有72份有菌数的增长。
3．Samuel用人的巨噬细胞培养ML，55次实验中有37次有1．5～3个月以上的时间内见到抗酸杆菌(AFB)增长2～9倍，并证明这种AFB的增长可被抗麻风药物抑制。
综上所述，ML培养是一个相当重要而又十分困难的问题。要解决无细胞培养问题就需要了解菌的适宜生理环境和必要的营养要求，要解决细胞培养就需要解决ML世代时间比一般细胞长得多所出现的问题。
二、麻风杆菌的鉴定
(一)ML增殖的标准
1．接种物 不管是取自人还是动物的接种物，其中必须含能定量的菌，取自人的接种物应来自未经治疗的病人。标本都要新鲜、要严格地按无菌操作进行。
2．要有肯定的增殖 在显微镜下增殖倍数应该在100倍以上。
3．获得菌应是活菌 这点极为重要。在培养时应监测菌的活力。
4．结果能在其它实验室重复。
5．分离率要在50%以上，且从少菌型病例取得的菌也能增殖。
6．如果发现非抗酸菌存在，则在体内或体外条件下应能转变抗酸相。
(二)常用的麻风杆菌的鉴定方法
1．小鼠足垫接种试验 其具体方法除菌悬液由培养物制备外均同常规小鼠足垫接种法(见第四章)。
2．麻风菌素试验 用培养物制成完整ML脊原，在麻风病人作皮肤试验并与标准麻风菌素的结果做比较。
3．DOPA氧化酶活性测定试验 本法是Prabhakaran1976年首次提出的。他发现在ML中有一种双酚氧化酶(0－diphenoloxidase)的特异的结构酶。在哺乳动物及植物细胞中亦含有0－diphenoloxidase，但主要氧化L-DOPA(3．4－二羟苯丙氨酸，3．4－dihydroxydiphenylalanine)成为DOPA色素，其最高吸收峰在475纳米处，而对D－DOPA或DOPA的衍生物诸如肾上腺素和去甲肾上腺素活性则极低。ML的DOPA氧化酶与之不同，该酶能使D－和L-DOPA转变为吲哚－5．6－醌，其最大吸收峰在540纳米处。所以能与DOPA色素相区别。此外，ML的DOPA氧化酶还能氧化各种酚类底物成醌。这些结果虽然尚未被公认，但至今未见有力的反驳证据。
其测定方法有光电比色法、同位素示踪法和斑点法。这里只介绍光电比色法和斑点法。
(1)光电比色法：将含蛋白量为1．5～2．0毫克的ML悬液与L-DOPA溶液(用pH6．8的0．1M磷酸缓冲液配制，W／V，加菌悬液后，总体积为3毫升，DOPA的终浓度为0．002M)在37℃孵育30分钟，其后，将反应混合物在15000×G离心45分钟，取上清在540纳米处测吲哚－5．6－醌的吸收峰。为排除自身氧化作用和酶性反应，试验要设ML悬液的DOPA溶液对照和含与试验管同量的100℃煮沸15分钟的死ML悬液的DOPA溶液对照。
(2)斑点法：取1滴ML悬液(含菌量为1×109)加至一白色瓷板上，再加一滴0．5MKH2PO4－Na2HPO4缓冲液(pH6．8)和0．01ML-DOPA溶液。置湿盒内于室温下放置16～24小时后观察是否有深紫色产生，更简便的方法是将滤纸事先浸在含DOPA的缓冲液中，于空气中干燥后置干燥器内保存，用时取出滴上一滴菌悬液观察有无反应。
4．吡啶提取抗酸性试验 系统而完整的简化方法是Convit1972年提出的。基本原理是ML经与新鲜吡啶作用(提取)2小时后，再用Z-N氏法染色不显示抗酸染色的特性，但仍不失革兰氏染色特性。其简单的做法是：
(1)制做涂片和切片：将受试菌株在Hanks平衡盐水中制成悬液(106～107／毫升)。在载片用金刚石笔刻一圆圈后将载片翻转，于对应的圆圈内滴一滴菌悬液，用吸管尖均匀涂膜，使膜大小与圆圈等大。如试切片，则取病损组织做冰冻切片。
(2)毗啶处理及染色：本试验由Campo－Aasen和Convit建立。其方法是：将标本(液体石蜡切片、冰冻切片或涂片)在Bouin液中固定5～16小时；浸于70%乙醇液中5分钟；浸于50%乙醇液中5分钟；用自来水冲洗2分钟；浸于新鲜的分析纯pyridine液中2小时；用自来水冲洗2分钟；于福尔马林液中固定1小时。最后用Z-N氏法染色，镜下观察有无抗酸性。本试验需设同样的不经pyridine提取的对照。
5．麻风杆菌特异抗原的检测试验
(1)荧光麻风抗体吸收试验(FLA-ABS)：由Abe氏1976年创建(见免疫章)。
(2)单克隆抗体鉴定法：由我国吴勤学等建立。
a．抗原制则备和包被：先将被检培养物高压(15磅20分钟)，再经超声波处理60秒后用离心法制得含均匀单菌的悬液，在420纳米处调悬液的光密度(OD)值为0．50～0．60，做为抗原包被液，然后按0．1毫升／孔包被于微量滴盘，于37℃保温至干。
b．第一次反应：加0．2毫升2．5%去脂牛奶于包被抗原的各孔。37℃，2小时，倾去封闭液用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗3次，加0．1毫升抗PGL－1单克隆抗体液(1∶2000)于每孔，37℃，1小时。
c．第二次反应：倾去单克隆抗体液，用PBS冲洗3次，加HRP－IgM(兔抗鼠)液0．1毫升于每孔(1：2000)，37℃，1小时，倾去HRP－IgM液后用PBS冲洗3次，加OPD-H2O2液，37℃20分钟后取出再加2．5NH2SO4液中止反应，于490纳米处计算OD值。
上述两试验均应设空白、阴性及阳性对照。