制片方法与染色技术

出处：按学科分类—医药、卫生 科学普及出版社《麻风病实验室工作手册》第70页（11000字）

一、制片方法

组织标本经一定操作程序制成极薄的切片，才能在光镜下观察和保存。以下介绍石蜡切片，苏木素－伊红染色以及抗酸染色的方法。

(一)固定

组织离体后，在一定时间内仍可继续成活，因此取材后要立即固定，借助化学药品的作用，破坏细胞酶的作用，防止组织变形、变质和自溶，以保持组织、细胞的形态结构。

常用10%中性福尔马林固定、它有染媒作用，可以加强染色性，使组织、细胞着色艳丽。一般固定24～48小时，最长不要超过4周，时间过长会使组织变硬，难以制片。如短时内不能制片，可放于5%中性福尔马林液中保存。

若用95%酒精固定，则宜在24小时后移至75%酒精中保存。酒精是还原剂，易被氧化为乙醛而变酸，影响染色性。且高浓度的酒精能使组织急骤收缩，使组织变硬变脆，造成不可逆的组织变形。

固定液的用量一般是标本体积的10～15倍。要用大口瓶。

(二)脱水

每份标本在脱水前，用铅笔写一张小纸条连同组织标本一起放入脱水盒。

脱水的目的是将组织中水分除净，有利于组织透明与透蜡。脱水不彻底，会影响透明与透蜡，也切不出好的片子，甚至因组织块含有水分而引起组织变性，不能永久保存。

脱水的方法应逐步进行，不可操之过急，否则会引起组织强烈收缩，以致组织内部脱水不净，或使组织发生变形。

常用的脱水剂为酒精，或丙酮。酒精可与水和二甲苯相容。酒精能硬化组织，它的脱水力强，穿透速度快，可使组织发生明显的收缩。通常脱水是从低浓度开始逐步递升，这样可保持组织中的水分慢慢递级除净，脱水彻底，而后才能将组织移至透明剂中。如果组织在透明剂中经一定的时间仍末透明，组织中间呈白色，这是脱水不彻底的缘故。遇到这样情况，可将组织倒回到80%酒精中，重新脱水。这比在组织包埋后重新脱水效果要好。

(三)透明

在制片过程中有两次透明。第一次是在透蜡前脱水后，第二次是在染色以后。组织透明的目的是便于透蜡包埋，切片透明的目的是有利于显微镜的观察和切片永久保存。脱水剂不能和石蜡相混合，必须经过透明剂的“媒介”作用才能使石蜡透入，透明剂既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，起到“桥梁”作用。当组织全部为透明剂占有时，光线可以透过，此时组织呈不同程度的透明状态，此种现象为透明。第二次透明是在染色之后，切片须经过3次透明才可封盖，如果在透明剂中出现云雾状，则表明透明剂中含有水份，此时须更换溶液，否则切片封盖后镜下观察是模糊的。也可在透明剂中加入无水硫酸铜(必须用滤纸包好放入)吸取水份，当硫酸铜呈现蓝色时，可以烤干再用。

常用的透明剂为二甲苯、氯仿、香柏油等。其中最常用的是二甲苯，无色透明。二甲苯是挥发性液体，透明力强，毒性低，价格便宜。二甲苯作用较快，易溶于酒精又能溶解石蜡，并能与封藏剂树胶相混合；它的最大的缺点是能使组织收缩变硬变脆，故使用时要掌握时间，不能停留过久。

透明时间根据组织大小而定，要更换溶液，将酒精完全置换出来。

(四)浸蜡

浸蜡的目的在于除去组织中的透明剂代以石蜡渗入组织内部，使软组织提高到一定的硬度，便于包埋和切片。

透明 通常在60℃温箱内进行，温度与石蜡的熔点相近。浸蜡的时间须根据组织标本的类型及大小而定，一般是4小时以上，最长不超过24小时。皮肤含纤维和脂肪较多，浸腊时间较长。

石蜡因熔点不同分软蜡和硬蜡，软蜡熔点低，为42°～45℃，45°～50℃，硬蜡熔点为52°～54℃，56°～62℃，在使用时需要根据切片时的室温以及组织类型配制各种熔点的石蜡。

1．浸蜡时石蜡的硬度与组织硬度要相近，组织硬时用硬蜡，反之用软蜡。

2．根据室温选用石蜡，夏季室温高可用56°～58℃或更高熔点的石蜡。如室温为10°～19℃，则选用熔点为52°～54℃的石蜡。冬季室温较低，如无恒温室设备时，以选用熔点为46°～48℃的石蜡为宜。(见表3－1)

表3－1 切片厚度和室温对使用石蜡熔点的计算表

3．浸蜡的要点

(1)要使石蜡渗入到细胞的每个部位，即使是空泡也要完全渗入，否则无法切片。

(2)要使石蜡紧密均匀贴在细胞内外面上，让组织与石蜡形成不可分离的状态。

要达到上述二点要求，必须掌握和控制浸蜡时间和温度，并与石蜡的熔点要相匹配。

(3)浸蜡的组织必须经过数次更换，如石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，这样可完全除尽组织中含有的剩余透明剂，以免影响切片。

(4)石蜡配制和选择：市场上有生物切片用和工业用两种石蜡。前者质较纯，用前必须经过煮炼。方法是加温到70℃熔化，凝固后再熔化，反复多次，以除净石蜡内的气体，增加石蜡的密度、粘性和韧性，再过滤或沉淀后使用。

测定石蜡熔点的方法 在盛石蜡容器的四周，出现石蜡凝结现象时，把温度计插入石蜡中，此时的温度就是石蜡的熔点。配制时一般是硬蜡1份，软蜡2份，蜂蜡1%，煮熔混合冷却，反复几次，如果熔点偏高可加软蜡，反之加硬蜡。用过的废蜡过滤后还可重新使用。

组织脱水、透明、浸蜡的程序分三组(见表3－2)

表3－2 标本脱水、透明、透蜡时间

*hr=小时；* *’=分钟

(五)包埋

将已透进石蜡的组织标本包埋在石蜡中，便于切片。

包埋的方法 先将已熔化的石蜡加温到60°～70℃时，倒入包埋框内。再将组织块从温箱取出，用热的镊子夹取组织块放入包埋框的底部。包埋时注意表皮与切面垂直放置，再将写好病理号的小条插入包埋框中，待冷却后，修成长方形的蜡块。贴上病理号码，待切片。

石蜡包埋 包埋用的石蜡过硬时，切片易碎，如过软、切面又易挤缩。石蜡包埋时要注意以下几点：

(1)包埋蜡的温度要略高于透蜡的温度。透蜡在60℃温箱内进行，而包埋蜡在温箱外，须加热到70℃，此时，组织才能紧紧包埋于石蜡中。这样可避免切片放入水中时蜡带与组织分离，影响切片质量。

(2)包埋时用的镊子切勿太热，要防止烫伤组织，造成人工现象。

(六)切片

将已修好的蜡块，装在切片机上切出极薄的合格的切片。须有一台精密的切片机和锐利的切片刀。切片厚度为4～6微米，切下来的蜡带在40℃水中展平后，附贴在玻片上，于60℃温箱放置2小时后即可染色。如作苏木素－伊红(HE)染色，玻片可不涂蛋清甘油，染色效果更佳。如作抗酸染色，则一定要涂上蛋清甘油，以防在染色过程中脱片。(Mayerd甘油蛋白液配法：新鲜鸡蛋白、甘油各半，加麝香草酚或柳酸钠少许(可略)充分搅拌，过滤或沉淀后使用)。

切片要点：

(1)切片机要精密准确。

(2)切片刀要锐利。

(3)切片时组织表皮要向上。

(4)每张切片都要用玻璃刻字笔写上病理号。

(七)染色

是染色剂和组织及细胞相结合的过程，使它们的结构、形态显示出来，使切片能用光学显微镜进行观察。染色可分为普通染色和特殊染色。普通染色也称常规染色即HE染色。为了显示和确定组织及细胞中某种特殊物质或变性或病原体等都要用特殊染色来证实，抗酸染色方法是特殊染色方法中之一种。

(八)分化

分化的目的是将浓染部分退至适当的程度，同时也将不应受染而由于吸附作用染上的颜色去掉。如苏木素染色，细胞核被染过浓，细胞浆也吸附上一些染料，必须经过分化液的作用，使细胞核着色褪到适当的程度，细胞浆上吸附染料完全除去。肉眼观察其颜色，由原来的深蓝色变为粉红色，或可再用弱碱性水溶液处理，使蓝色加深。细胞核呈鲜蓝色，细胞浆及纤维组织为无色。

任何一种染色法都需要进行分化，才能使各种颜色清晰易见，但是分化剂的浓度和时间成正比，须严格操作。

盐酸、醋酸、硫酸等是常用的分化剂。

(九)封固

切片经过染色、脱水、透明后即可用封固剂加盖玻片封盖，有利于镜下观察和永久保存。常用的封固剂为中性树胶(上海产)。

(十)归档

组织切片、蜡块、送检单三者的病理号要一致，切片后蜡块的切面要涂上约1毫米厚石蜡封固，送检单装订保存。

二、染色程序及方法

(一)染色前后的处理

石蜡切片在进行各种染色前都必须经过脱蜡、水洗处理。用二甲苯溶解切片上的石蜡，再用由高浓度至低浓度的各级酒精洗掉二甲苯，并逐渐增加水分，最后经自来水至蒸馏水洗后方能进行染色。

石蜡切片在染色前的脱蜡、水洗必须彻底，否则会影响切片着色均匀，尤其是在二甲苯内的脱蜡时间宁长勿短，时间短，脱蜡不净必然影响染色效果。如需快速或室温低时，可在水浴箱中进行脱蜡。为了保证质量，应视工作量的不同到一定时间需将二甲苯和酒精更新。染色后凡是可用干性封固剂封藏的各种染色切片，均需经过脱水、透明、封固过程。这样可全部除净存留在切片上的水分及漂浮的染色液。无论使用什么脱水剂脱水，都要脱水彻底，还应注意脱水剂对很多染色有分化或对某些颜色有减弱作用，故脱水时间不宜过长。

经过透明剂的作用，将脱水剂置换出来，使组织具有适宜的折光率，再用中性树胶封盖。组织切片保存在载玻片与盖玻片之间，不与空气接触，可防止氧化褪色，便于镜检和保存。

(二)苏木素－伊红(HE)染色

1．方法：

(1)切片经二甲苯脱蜡二次 每次10～20分钟

(2)100%酒精(或用95%酒精) 1～5分钟

(3)95%酒精 1～3分钟

(4)80%酒精 1～2分钟

(5)水洗→蒸馏水洗

(6)依利希(Ehrlieh’s)苏木素 20分钟

(7)水洗

(8)1%盐酸酒精(70%酒精配制)分化 1～2分钟

(9)水洗，在自来水中复蓝10～30分钟，在镜下控制分化的程度是否适宜。

(10)0．25～0．5%醇伊红染色 1～2分钟

(11)迅速水洗 1～2分钟

(12)80%酒精 1～2分钟

(13)95%酒精 1～2分钟

(14)95%酒精Ⅱ 1～2分钟

(15)100%酒精Ⅰ 1～2分钟

(16)100%酒精Ⅱ 1～2分钟

(17)100%酒精和二甲苯等量混合液 1～2分钟

(18)二甲苯Ⅰ 1～2分钟

(19)二甲苯Ⅱ 1～2分钟

(20)二甲苯Ⅲ 1～2分钟

(21)中性树胶封固

2．结果 细胞核被苏木素染成艳丽蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色，细胞浆被伊红染成深浅不同程度的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色，胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红细胞呈桔红色，蛋白性粘液体呈粉红色。

质量好的HE染色切片，细胞核与细胞浆蓝红相映，鲜艳美丽，胞核鲜明，核膜及染色质颗粒均清晰可见。

3．染液配制

(1)Ehrlich’s苏木素染液

苏木素 2．0克

无水酒精 100毫升

甘油 100毫升

蒸馏水 100毫升

冰醋酸 10毫升

钾明矾 10克

Ehrlich’s 苏木素，染色性好，细胞着色艳丽，不易褪色，染液稳定，着色均匀，冬夏季都适用，不易产生沉淀物。

先将苏木素溶于酒精中，然后加入甘油。另将钾明矾溶于蒸馏水。再将两液混合，加入冰醋酸，充分混合均匀后置于阳光充足处经常摇荡，大约6周至3个月，待自然氧化成熟，溶液呈红褐色，过滤后备用。如急需用，可加碘酸钠0．3克，加速氧化成熟，立即可以使用。

(2)酒精伊红溶液

伊红Y 1．0克

蒸馏水 200毫升

冰醋酸 30毫升

先将伊红溶于100毫升蒸馏水中，待溶解后，加入30毫升冰醋酸。边加边搅拌，呈絮状时再加蒸馏水100毫升。静置30分钟过滤。取其沉淀物，在60℃温箱内烤干，使用时用95%酒精溶解，配成0．25%～0．5%酒精伊红溶液。

(三)抗酸染色

近年来带用的有三种方法，各有利弊。这里分别介绍Wade-Fite法、改良Harada法及Fite法。

1．Wade-Fite法

(1)方法

1)切片用松节油和汽油等量混合液脱蜡两次，每次20分钟。

2)自然干燥(让油渍挥发)。

3)水洗。

4)石碳酸复红染色20～30分钟(室温)。

5)水洗。

6)10～20%硫酸溶液分化两次，每次1～2分钟。

7)充分水洗。

8)苏木素复染(宜浅)3分钟。

9)水洗。

10)1%盐酸酒精(70%酒精配制)分化(宜快)。

11)自来水洗，5～10分钟。

12)自然干燥。

13)中性树胶封固。

(2)结果：抗酸杆菌呈鲜红色；细胞核呈蓝色。

2．改良Harada异染法

此法是经高碘酸处理后再染色，细菌不易褪色，可保存3年以上。

(1)方法：

1)切片经松节油汽油等量混和液脱蜡两次，各20分钟。

2)切片自然干燥。

3)水洗。

4)10%过碘酸氧化30分钟以上。

5)水洗。

6)石碳酸复红20～30分钟。

7)水洗。

8)10～20%硫酸溶液分化两次，每次1～2分钟。

9)充分水洗。

10)Weigert酸性铁苏木素2分钟。

11)水洗。

12)0．03%甲基蓝苦味酸染5～10分钟。

13)水洗。

14)自然干燥。

15)中性树胶封固。

(2)结果：抗酸杆菌呈鲜红色，细胞核呈棕黑色，结缔组织呈黄绿色，表皮和肌肉呈淡黄色。

(3)溶液配制

1)Weigert铁苏木素

A液 苏木素 1．0克

无水酒精 100毫升

B液 29%三氧化铁 4毫升

浓盐酸 1毫升

蒸馏水 95毫升

以上A、B两液配制后要分别存放，通常4周后方可使用。用前两液等量混合，呈褐色，此液易发生沉淀，用后要弃掉。

2．甲基蓝苦味酸溶液

甲基蓝 0．03克

苦味酸饱和液(1．22%) 100毫升

3Fite方法

(1)方法：

1)切片经花生油二甲苯(3∶1)脱蜡两次，每次12分钟。

2)滤纸吸干油渍。3)水洗。

4)石碳酸复红复染30分钟。

5)水洗。

6)1%盐酸酒精脱色至粉红色(约1分钟)。

7)水洗。

8)0．15%美蓝复染。

9)水洗。

10)自然干燥。

11)中性树胶封固。

(2)结果：

抗酸杆菌呈红色，细胞核呈蓝色。

(3)美蓝液的配制：

0．15克美蓝溶于95%酒精100毫升后再1：1稀释。

五、皮肤组织制片常见误差

在制片中如能按操作规范程序进行，则可减少或避免因制片失误产生的人工现象。

1．在镜下常见切片的局部表皮组织有破碎细胞或组织呈多形性嗜碱性变，这种变化有两种可能性：

(1)取材时产生的人工损伤。

(2)组织和细胞处于修复过程中。

2．结缔组织呈淡粉红色云雾状肿胀或细胞和组织呈淡蓝色一片，见不到细胞和组织的结构，这种现象是因为组织没有立即固定，发生自溶，使细胞完全消失，这种溶解叫染色质溶解，对染料产生拒染。这种现象是不可逆的，只有重新取材。

3．蜡块切面不完整或蜡块表面不透明，常见有下列原因：

(1)组织脱水过急或脱水剂使用次数多，时间过久，因而脱水不彻底，蜡块的切面呈灰白色或切不下来，此时应更换脱水剂，或按原顺序将组织倒回到80%酒精中重新开始脱水。

(2)蜡块的切面呈白色不透明，且表面粗糙，不易切下来，即使勉强切下来，因挤压而组织变小，这是透蜡时间或湿度不够所致，需重透蜡。

(3)组织硬脆呈褐色不透明，是因为透蜡或包埋温度过高，无弥补方法。

4．通常透蜡是在60℃温箱中进行，但透蜡的时间和温度、石蜡的熔点都要相匹配。时间过长，温度偏高，均会使组织硬脆，无法切片；温度低于石蜡熔点，将起不到透蜡的作用。

5．镜下见到炎症细胞呈条索状(病变特征除外)，可能是取标本时夹持过度或切片刀不锐利形成的挤压所致。

三、切片时的注意点：

1．蜡块装在切片机上，表皮应向上，这样切片时可减少刀痕。

2．制片时要考虑皮肤组织标本的不同情况，如大疱性疾病切片蜡带在水盆中伸展时，水温应低些，以免大疱破裂内容物脱落而影响诊断。

3．作细小丘疹性疾病的切片，在切片机上修蜡块时，当组织露出后，要立即贴片，以免漏掉典型病变。

4．为了利于病理诊断，每张玻片需3－4个切片，以利观察。

5．切片时注意使水温与石蜡的熔点相近，．以免水温过高引起蜡带的融化，造成组织水肿或裂隙的假象。