维生素B1的测定

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第145页（4849字）

维生素B₁(硫胺素，抗神经炎素)，其测定方法有荧光计法和荧光目测法两种。

方法一：荧光计法测定维生素B₁

维生素B₁在碱性铁氰化钾溶液中可被氧化生成一种蓝色荧光物质——硫色素。在标准情况下，如果不存在其他荧光物质，溶液的荧光强度与硫胺素的浓度成正比。如果样品中含杂质过多，应经离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分开。

试剂

(1)无水硫酸钠。

(2)15%氢氧化钠溶液：称15克氢氧化钠溶于蒸馏水中，稀释至100毫升。

(3)1%铁氰化钾溶液：1克铁氰化钾溶解于蒸馏水，定容至100毫升，置棕色瓶中，冰箱保存。

(4)碱性铁氰化钾溶液：取1毫升1%铁氰化钾溶液，用15%氢氧化钠溶液稀释至15毫升，临用前配制，避光存放。

(5)0．1N硫酸溶液：取2．8毫升浓硫酸(比重1．84)定容至1000毫升。

(6)0．1N盐酸溶液：取8．5毫升浓盐酸(比重1．19)用蒸馏水定容至1000毫升。

(7)2．5M醋酸钠溶液：称205克无水醋酸钠以蒸馏水溶解，定容至1000毫升。

(8)丁醇：114℃～118℃重蒸丁醇，也可用异丁醇。

(9)淀粉酶溶液：用淀粉酶制剂临用前配成2%的酶溶液或用2．5M醋酸钠溶液配成酶悬浮液。

(10)25%氯化钾溶液：称250克氯化钾溶解于水中，定容至1000毫升。

(11)25%酸性氯化钾溶液：取8．5毫升浓盐酸(比重1．19)以25%氯化钾溶液稀释至1000毫升。

(12)硫胺素标准贮备液：将在氯化钙干燥器中放置24小时的硫胺素，准确称取100毫克溶于25%乙醇或0．01N盐酸中，稀释至1000毫升，冰箱5℃保存数月。此液为0．1毫克／毫升。

(13)硫胺素标准液：将贮备液稀释1000倍，以冰醋酸调至pH4．5，临用前配制。此液为0．1微克／毫升。

(14)95%乙醇。

(15)3%～5%醋酸：取30毫升冰醋酸以水稀释至1000毫升。

(16)硫酸奎宁贮备液：称100毫克硫酸奎宁溶于0．1N硫酸中，稀释至1000毫升，置棕色瓶中，保存冰箱中，若溶液变浑，应重配。(0．1毫克／毫升)。

(17)硫酸奎宁溶液：取1．5毫升硫酸奎宁贮备液以0．1N硫酸稀释至1000毫升(此液0．15微克／毫升)。

(18)活性人造沸石：使用30～50目及60～80目的混合体，若溶液中样品含量高于7微克时，可用60～80目。

(19)人造沸石的活化或再生：100克人造沸石，以10倍于其容积的热3%醋酸搅拌二次，每次10分钟，再用五倍容积的热25%氯化钾搅拌15分钟，用热3%醋酸搅拌10分钟，然后，用热蒸馏水洗至无氯离子为止，最后放在布氏漏斗抽干，100℃以下烘干，保存于密封的广口瓶中。

若处理后活力不高，应重复处理，或增加25%氯化钾处理次数。

若人造沸石含有大量铁时，可用酸性氯化钾洗涤。

人造沸石的活力不稳定，活力随贮存而降低，使用前必须试验其吸附硫胺素的能力，要求硫胺素的回收率达92%以上。

操作步骤

1．提取

(1)精确称取一定量磨细的样品(硫胺素含量在10～30微克之间)，置100毫升锥形瓶中，加入75毫升0．1N盐酸，在沸水浴上加热半小时，不时摇动(经验取样量：水果、蔬菜、鱼类可取样15～20克，谷类、肉类2～5克，豆类、干果类5～10克)。

然后用2．5M醋酸钠调节pH为4．5，(用溴甲酚绿为外指示剂。变草绿色)。

(2)提取液冷至室温，加入淀粉酶悬浊液，以使结合性硫胺素呈游离状态。

(酶的用量：动物、干植物样品每克加20毫克，新鲜蔬菜水果，1克样品加3毫克)。

45℃～50℃保温3小时。冷至室温用水稀释至100毫升，过滤备用。

2．纯化

(1)将人造沸石装入层析柱中，体积约占管长1／3，用蒸馏水洗，然后取25毫升提取液，加入层析柱中，提取液通过沸石的速度为60滴／分左右(加入提取液量的多少，根据所含硫胺素的浓度大小而定，使硫胺素的总量在2～5微克之间)。

(2)用热水洗层析柱3次，每次用10毫升，弃去洗液。

(3)用10毫升热酸性氯化钾洗脱，待完全滤下后，再加10毫升。收集洗脱液于25毫升容量瓶中，冷却后，用酸性氯化钾溶液定容至刻度。

(4)取25毫升(0．1微克／毫升)硫胺素标准液，加入另一层析柱中，重复②，③步骤，纯化标准硫胺素溶液。

3．氧化：

取4支分液离心管，按表9加入试剂：

表9 不同试剂加入量

〔注〕单位：毫升。

以上试剂加完后，剧烈摇动90秒钟。将上述四个分液离心管离心，使丁醇与碱液分层清楚。

小心将各管的下层碱弃去，并各加1～2克无水硫酸钠脱水，摇匀、离心。

4．硫色素的测定：

先用硫酸奎宁应用液校正荧光计，选用365nm为激发波长，在435nm处测定，然后测定空白管、标准管、样品管的相对荧光强度。

5．计算：

式中 E₁：样品管荧光读数；

E₂：样品空白管荧光读数；

E₃：标准管荧光读数；

E₄：标准空白管荧光读数；

C：标准溶液浓度；

V₁：经柱体积(毫升)；

₂：稀释体积(毫升)；

W：样品重量(克)。

方法二：荧光目测法测定维生素B1含量

本法原理基本与荧光计法相同，提取液在碱性溶液中，氧化硫胺素为硫色素。在紫外灯下与标准液产生的荧光强度比较，求得样液中硫胺素的相应含量。

试剂和仪器

(1)水饱和正丁醇(114℃～118℃)：取适量正丁醇置分液漏斗中，加过量的水，振摇20分钟，放置过夜，弃去水层，得上面的澄清饱和液。

(2)抗坏血酸溶液：称抗坏血酸0．96克，加水15毫升，此溶液1毫升含65毫克抗坏血酸。临用时配制。

(3)碱性铁氰化钾：取20%铁氰化钾溶液1．8毫升，加40%氢氧化钠溶液10毫升，临用时配制。

(4)其他有关试剂的配制参见荧光计法。

(5)紫外灯：波长3650。

操作步骤

1．样品处理：

取捣碎混匀的样品20克(样品量视硫胺素含量而定)，置250毫升烧杯中，用0．05N硫酸75毫升调成匀浆后移入250毫升脂肪瓶内，在水浴中加热30分钟，用2．5M醋酸钠溶液调pH为4．5，即溴甲酚绿(外指示剂)在溶液中变草绿色。移入100毫升容量瓶中，定容，过滤。

2．去除杂质：

吸取上述滤液45毫升，放入125毫升分液漏斗中，加入20%铁氰化钾溶液1毫升，混匀，加入1毫升抗坏血酸溶液，混匀，用水饱和正丁醇液洗2次，每次振摇2分钟后，静置分层，(必要时可离心)，去除正丁醇相，剩下溶液作测定用。

3．测定

(1)吸取样液20毫升，置125毫升分液漏斗中，加入2毫升甲醇，1毫升碱性铁氰化钾，混匀1分钟后，立即加入8毫升正丁醇，振摇2分钟，待分层后放出下层水液。吸取上层正丁醇样液6～8毫升，置干试管中，加入0．6～0．8毫升无水乙醇(脱水)，混勺。

(2)吸取硫胺素标准溶液(每毫升含1微克硫胺素)，10，12，14，16，18，20毫升，分别置125毫升分液漏斗中，按上述①方法同样操作，得各标准管的正丁醇液(含有乙醇)。

(3)空白管是加入30%氢氧化钠溶液1毫升(破坏硫胺素)以代替1毫升碱性铁氰化钾溶液，其他操作也按上法进行。

(4)各吸取1毫升上述样品液，标准液，空白液置1厘米比色皿中，在暗室中用紫外光照射，仔细观察蓝色荧光的强度。观察样品溶液蓝色荧光强度与哪一标准液荧光强度相一致。同时观察空白液有无蓝色荧光。

根据相应标准液中硫胺素的含量，计算出样品中硫胺素的含量。若空白液中有荧光，计算样品含量时应扣除空白。