果蔬汁微生物学与生产过程的微生物管理
出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《软饮料工业手册》第346页（9545字）
(一)果蔬汁中的主要微生物
果蔬汁中含有糖、无机盐、水等营养成分，因此刚榨出的果蔬汁具有微生物生长的良好条件，在生产过程中会发生微生物污染，有时会导致果蔬汁的变质、败坏，严重影响果蔬汁的质量。为此在果蔬汁生产过程中必须加强卫生管理，防止微生物污染。
果蔬汁属于酸性或低酸性食品，pH由柠檬汁的2．4到番茄汁的5．0，在较大范围内变动，但一般果汁均在pH3左右的酸性范围内。由于酵母、霉菌生长的pH范围为2～11，乳酸菌、醋酸菌生长pH3．0～4．0，其他细菌生长pH4．5～9．5。由此可见，醋酸菌、乳酸菌以外的一般细菌在果汁中是难以生长的。因此危害果蔬汁的微生物主要是酵母、霉菌和醋酸菌、乳酸菌等细菌。
1．酵母
酵母是污染果蔬汁及其饮料并使之败坏的最重要的一种微生物。柑橘类的果实和果汁中均存在较多的酵母。特别是收获后的果实，其表面有时多达1亿个微生物。从葡萄柚汁分离出的酵母有啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴氏酵母(S．Pastorianus)、汉逊酵母属(Hansenia spora)、啤酒醭酵母(Mycoderma cerevisiae)和红酵母属(Rhodotorula)。在浓缩果汁中发现红酵母属，同时还有能在65°Bx橙汁中生长的高渗透性的结合酵母属(Zygosaccharomyces)，即鲁氏酵母(S．rouxii)。这些酵母可以消化果糖、葡萄糖和甘露糖，但不能使蔗糖发酵。酵母的生长在4．4℃以下温度受到抑制，但结合酵母在pH3．0、糖含量70%条件下还能使橙汁发酵。浓缩汁中还发现假丝酵母(Candida)、毕赤氏酵母属(Pichia)、克氏酵母属(Kloeckera)等，但柑橘加工厂的酵母多为假丝酵母、酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属和毕赤氏酵母属。
苹果加工时，从健全果实的果皮、芯、鲜果汁中分离出假丝酵母、罗氏隐球酵母(Cryptococcus)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属。果实和新鲜果汁中多为无孢子酵母。发酵苹果汁中主要是有孢酵母。有孢酵母来自二次污染，用低压碳酸气贮藏的苹果汁发现汉逊酵母产生的薄膜，有时生成酯，以致改变果汁香味。
葡萄汁根据栽培地区的土壤、气象和有无发酵等，情况有所不同，但多半是柠檬形克氏酵母(Kloeckera apiculata)和啤酒酵母。此外也有汉逊酵母、毕赤氏酵母、球拟酵母、酒香酵母属(Brettanomyces)、红酵母和假丝酵母等。酵母属中还发现耐亚硫酸的路德酵母(S．ludwigii)。
对于浓缩果汁来说，高糖度和高酸度大都能阻碍细菌的繁殖(有时也存在乳酸菌)。浓度超过60°Bx时，酵母和霉菌的生长受到限制。但如上所述，高渗透性的鲁氏酵母、蜂蜜酵母(S．mellis)等能在高糖度果汁或浓缩果汁表面生长，产生弱的酒精发酵。如果在适合的温度下，在70°Bx(相对密度1．349)果汁中也有酵母生长。通常酵母生长的水分活性(Aw)为0．95～0．85，耐渗透性酵母生长的最低Aw达到0．65～0．70，在80°Bx糖浆中也能生长。糖度高的汁液吸湿性强，其表面往往形成糖度低的薄层，酵母可以在此表面薄层内生长。因此浓缩果汁有时也会在表面薄层处产生发酵现象。
2．霉菌
果汁中出现霉菌的频度比其他微生物少，果蔬汁饮料霉变的可能性也比发酵或酸化的可能性小得多。但霉菌往往成为二次变化的原因，导致果蔬汁质量下降，有时会造成严重损失，因此也必须充分引起注意。
在霉菌中因青霉菌(Penicillium)污染而使果汁和果汁饮料质量降低的事例较为常见。由于霉菌是需氧菌，浓度较低的碳酸气也能阻碍霉菌生长。霉菌往往生长在饮料表面，偶尔也出现在饮料内部。受霉菌危害的果蔬汁会出现霉斑和霉味，有时还会出现苦味。青霉属中也有对果蔬汁无害的菌种。相反，在苹果汁中，霉菌虽很微弱，但也有生长和迅速繁殖的扩展青霉(P．expansum，又称苹果青霉)。扩展青霉造成水果褐色腐败，是果汁产生棒曲霉素(Patulin)的主要根源。受霉菌侵害的苹果，腐烂处的棒曲霉素含量高达200～290mg／100g。用腐败苹果生产的果汁会产生棒曲霉素的污染。对于果汁中的棒曲霉素含量一般国家规定不超过50μg／L，有些国家规定不得超过25μg／L。扩展青霉不仅危害苹果，还危害梨、杏、番茄等果蔬原料。特别是受损伤的水果更易被损害，机械化收获的仁果类水果，如果不能及时冷藏很容易被扩展青霉污染。
另外，灰绿青霉(P．glaucum)容易污染外皮受伤的水果，使果肉变软，然后出现蓝绿色的孢子层，形成绿色腐败。此外果汁也会受到拟青霉属(Paecilomyces)、红曲霉(Monascus)和瓶霉属(Phialophora)等的污染。霉菌对于通常的低温杀菌温度是能承受的。但即使少量霉菌的生长也会产生不快的霉臭，因而具有一定的危险性。
果汁中有时也发现曲霉(Aspergillus)，与青霉的污染不同，曲霉不会使果汁质量迅速发生变化，危害程度小，但其中也有耐热性很强的孢子菌。
在刚榨出的果汁中还发现枝孢霉(Cladosporium)、格链孢霉(Alternaria)、节卵孢霉(Oospora)等，但在贮藏果汁中未发现这些菌类。
3．细菌
果汁中生长的细菌主要是乳酸菌和醋酸菌，有时也会发现已经致死的病原性细菌。在低温贮藏的鲜果汁中细菌可以长时间生存，果汁饮料也能生长细菌。
(1)乳酸菌 果汁中发现的细菌中，乳酸菌是主要菌种。虽然果汁本身也存在乳酸菌，但大多来自二次污染，在生产和贮藏过程中混入的。果汁中的乳酸菌原来是异质发酵型的，但在发酵果汁中也出现同质发酵型菌。多数乳酸菌在pH3．0～3．4的果汁中难以生长，在pH3．5以上环境下可以繁殖，但在其下限pH时，共生体(Symbionts)的存在会影响其生长。此外氨基酸、肽等的氮化合物也会影响乳酸菌的生长。
一般认为，在不杀菌的果汁中，多数乳酸菌对果汁不会构成危险。只有在酸少、pH高的果汁中才有增殖的危险，因此调节低酸果汁的pH是抑制乳酸菌生长的有效方法之一。
在pH3．5以上环境下，乳酸菌可以分解糖和有机酸，主要生成乳酸、碳酸气、醋酸、甘露糖醇和酒精。在pH3．0～3．4环境下，乳酸菌较少生长，但能与苹果酸、柠檬酸等有机酸作用，代谢产物除碳酸气外，还有乳酸、琥珀酸。在苹果汁中能生成少量的醋酸、双乙酰和3－羟基丁酮。
乳酸菌有时在果蔬原汁中生成黏质物，除明串珠菌属(Leuconostoc)外，胚芽乳杆菌(L．plantarum)和链球菌属(Streptococcus)等乳酸菌也会生成黏质物。黏质物的生成多半与蔗糖、葡萄糖和果糖等糖类的存在有关。
(2)醋酸菌多数见于过熟果和伤果，果汁中也常发现。苹果汁中的醋酸菌有氧化葡糖杆菌属弱氧化亚种(Gluconobacter oxydans subsp．suboxydans)、氧化葡萄糖杆菌亚种(Glu．oxydans subsp．melanogenus)、醋化醋杆菌醋亚种(Acetobacter aceti subsp．acet)。葡萄汁中有醋化醋杆菌木质亚种(Acetopacter aceti subsp．xylinum)、氧化葡萄糖杆菌氧化亚种(Glu．oxydans subsp．oxydans)。
(3)其他细菌 果汁pH较低，因污染引起的其他一般细菌的增殖和生长特别见于贮藏容器不卫生的场合，但在pH4．0以下的环境下细菌不会生长。pH4．0以上极端的低酸果汁中有时会产生丁酸发酵的例外情况，但决不会有致病菌生长。
蔬菜汁和蔬菜浆中的污染来自原料的土壤细菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、马铃薯芽孢杆菌(B．mesentericus)、凝结芽孢杆菌(B．coagulans)、肉毒梭菌芽孢杆菌(Clostridium botulimum)。蔬菜的弱酸性为微生物提供了良好的生长环境，其中许多细菌能在蔬菜汁中产生芽孢。因此在对蔬菜汁进行杀菌时应严格杀菌条件，有时需要采用高温杀菌工艺，在较高温度下保持较长的时间，以保证足够的杀菌强度。
(二)微生物引起的果蔬汁的变化
当果蔬汁中残留微生物，在处理和贮藏不当时，就容易使果蔬汁败坏，或使果蔬汁的感官、成分和香气发生变化。
新鲜果蔬汁在常温下的微生物变化，首先是酵母引起的酒精发酵，其次是产膜酵母引起的醇和酸的氧化。或者是在接触空气时由于霉菌和醋酸菌的存在，由乙醇生成醋酸。
果汁也会由于酵母种类、温度产生不同的变化，但最初通常是由尖头酵母(Apiculate yeast)等的野性酵母引起的生成适度酒精和挥发酸的发酵。当温度在32～35℃范围内时，多数酵母由于温度过高难以生长，但乳酸菌增殖产生乳酸和挥发酸。相反，在16℃以下温度时，野性酵母生长，而当温度进一步降低时，酵母的生长又受到抑制。
微生物对果蔬汁的影响，除通常酒精发酵以外，还有异型、同型乳酸菌引起的糖的乳酸发酵，乳酸菌的有机酸发酵以及黏质菌生成黏质物的作用。蔬菜汁含有糖分，酸含量少、pH5．0～5．8，富含微生物生长的因子，会产生乳酸菌的选择性增殖。
1．感官的变化
对于果汁来说，抑制凝胶化和澄清化，保持浑浊的稳定性是极为重要的。天然浑浊稳定性破坏主要是果汁中所含的果胶分解酶(特别是果胶酯酶)的作用。其次霉菌也会分解果胶。此外，微生物繁殖引起的果汁成分的变化还会产生浑浊和变色。增殖菌体产生的浑浊多数是伴有酒精发酵的酵母所为，其中发酵能力较弱的球拟酵母较为多见，常因瓶等容器清洗不干净引起的。另外拟青霉等耐热性的霉菌稍有生长就会引起果汁成分和感官的变化，产生霉臭，或者由于果胶酶引起果汁澄清化，瓶霉还会引起苹果汁的褐变。
2．生成酒精
酒精的生成通常是由酵母引起的，在原料果汁贮藏过程中容易产生。在用大型容器暂时或长期贮存时常检测到酒精的生成。
特别罕见的是有时细菌也会生成酒精。例如乳酸菌会由果糖、半乳糖和蔗糖生成乙醇、乳酸、醋酸和二氧化碳气。甘露醇杆菌(B．mannitopoeum)的某些菌株会将果糖变成酒精，明串珠菌属(Leuconostoc)的某些菌株能将葡萄糖变为酒精。
果汁中酒精由霉菌产生的情况与细菌一样，较为罕见，但在某些条件下，毛霉(Mucor)，其次镰孢霉(Fusarium)、曲霉属的某些菌株可以生成酒精。除酒精外，某些乳酸菌将果糖变为甘露糖醇。渗透性酵母在生成酒精的同时生成甘露糖醇。
甘油是酒精发酵中的酵母代谢产物，但曲霉、青霉中的有些菌株有时也生成甘油。
3．有机酸变化
果汁中的有机酸从量来说主要是柠檬酸、酒石酸和苹果酸，微生物会导致果汁有机酸的变化。
酒石酸及其盐类是有机酸中对微生物作用最稳定的，酵母不能作用，但为多数霉菌分解利用，细菌中仅限于胚芽乳杆菌、琥珀酸杆菌(B．Succinicum)、气杆菌属(Aerobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)等。
苹果酸由乳杆菌、明串球菌属等乳酸菌引起的分解和减少称为苹果酸－乳酸发酵(Malolactic fermentation)。在配制葡萄酒或其他果酒时，贮藏中出现酸含量降低或有不好变化时要引起重视。苹果酸由细菌分解除生成乳酸、碳酸外，还生成少量醋酸。中途也会生成琥珀酸。生成的乳酸和琥珀酸量因pH而不同，pH高时，琥珀酸增加。
果汁中苹果酸的分解受到pH的影响，氨基酸对其也有阻碍作用。此外，苹果酸分解还与各种因素有关。酵母在使果汁酒精发酵时会引起苹果酸少量分解。霉菌中，灰葡萄孢(Botrytis cinerea)分解苹果酸，而黑根霉(Rhiz．nigercans)生成苹果酸。
柠檬酸的变化，果汁中的乳酸菌除分解柠檬酸，生成乳酸和碳酸气外，还生成醋酸。醋酸生成会使果汁质量变差。柠檬酸霉(Citromyces)、曲霉、青霉、毛霉、葡萄孢霉(Botrytis)、暗孢霉(Dematium)和镰孢霉等霉菌分解或生成柠檬酸。
其他有机酸，例如酵母在酒精发酵时会生成少量琥珀酸。对于酸非常少的苹果汁，细菌会生成苹果酸。
(三)生产过程中的微生物管理
如上所述，果蔬汁中会有多种微生物，这些微生物的污染源主要是果蔬表面、生产设备和果蔬内部。如果来自果蔬的污染较为严重，则果蔬原料的微生物管理具有重要意义。反之如果污染主要来自设备，那么果蔬生产设备的卫生管理更为突出。
生产过程中的微生物管理重点可从以下方面着手：
1．加强果蔬的清洗与消毒
果实中微生物含量是果实质量的重要指标。研究表明，用腐败果制成的果汁，其中微生物的数量为用同样方法制成的健全果果汁的2500倍，多达13×106个／mL。表2－1－47为用一般方法榨出的果汁中的微生物数量。由表可见，酸含量高的葡萄柚一般细菌、霉菌、酵母较少，而酸含量较少的橘子的较多。霉菌、酵母对于一般菌数的比例，葡萄柚约36%、橙约25%、橘子仅有2%左右。酸含量高的果汁，酵母、霉菌比例较大。另一方面水果柠檬酸的含量与微生物数量有关，例如橙汁的柠檬酸含量0．6%以上时，一般菌数在50000个／mL以下。酸少时菌数增加。葡萄柚、橘子均有同样倾向。葡萄柚柠檬酸含量超过1．6%时，一般菌数与霉菌、酵母数量大致相同。相反，橘子含酸量低于0．5%时，酵母比例减少。由此可见，果实的含酸量很重要，随成熟度增加，果实的含酸量减少，因此需要对原料水果加强管理。
表2－1－47 刚榨的柑橘汁中的微生物
一般认为，果蔬表面附着的多数微生物，通过榨汁前的清洗已经减少很多，残存的微生物即使全部混入果蔬汁内，一般也不致影响果蔬汁的质量。但也有不同观点，美国Patrick在佛罗里达果汁厂进行的微生物学的研究表明，微生物是果实质量的重要因素，仅仅通过果实外部的清洗很难减少水果榨汁中的微生物。能够承受雨淋、日光消毒和各种喷雾剂作用的多数细菌，在柑橘汁等的高酸条件下也会迅速致死，但有些果蔬汁，例如番茄汁由于含酸量较低，对于附着土壤的原料必须充分洗净。
清洗方法根据果蔬种类而定，可以用水、洗涤剂清洗，也可以对水果表面进行刷洗，用氯消毒。通过清洗和消毒，使果蔬原料表面的微生物减少80%～90%。另一方面要剔除腐败果，防止果汁受污染。
2．生产设备的定期清洗与消毒
在从榨汁到果蔬汁产品的过程中，尽量减少微生物的污染是非常重要的。减少果蔬汁中的微生物对于加热杀菌和贮藏(特别是低温贮藏)是有利的。
果蔬汁中的微生物不仅来自果蔬原料，还来自生产设备。洗涤、设备、工艺等如果不当，就会显着受污染。例如葡萄汁加工，榨汁前经过加热几乎为无菌状态的原浆，在榨汁后也会生长2．5×105个／mL以酵母为主的微生物，这主要是由压榨机的框、布，以及所用容器、管道污染的。
此外，管件、阀门以及设备的死角处都有可能成为污染源，因此设备的设计、安装和操作管理应密切联系，尽可能防止污染。在生产的前后过程中，生产设备及其附属设施都必须进行有效的清洗和消毒，经常保持卫生状态。
生产设备的清洗和消毒应根据设备的种类、型式和工厂设施选定。生产规模大，设备先进，条件优越的工厂采用CIP(Cleaning In Place)方式清洗。CIP系统由泵、喷嘴、药液罐和自控系统组成。在一定的时间间隔内，适当组合水、热水和洗涤剂等自动对设备、罐和管道进行内部清洗和杀菌。果汁饮料生产线采用CIP清洗的程序可参照表2－1－48。由于CIP方式是在不拆卸生产线的密闭状态下清洗的，可以防止人为的二次污染。CIP清洗后，在下一次使用前需用热水或蒸汽进行杀菌。
表2－1－48CIP清洗顺序
另一种方式是将设备和管路拆开，用水、洗涤液和氯剂等进行清洗、消毒，系统装好后再用热水或蒸汽杀菌。设备的清洗和杀菌是防止果蔬汁微生物污染的重要操作，应该予以重视，并采用有效的方法。与此同时，生产现场的天花板、墙壁和地面也应保持清洁状态。
(四)果蔬汁的加热杀菌
果蔬汁加工，特别是在离心分离、过滤以及澄清过程中，来自原料的微生物有所减少，例如离心分离在去除浆质时，也会分离出80%以上的酵母。在4000r／m转速下离心分离，酵母数可减至14%～17%，在8000r／m转速下可减至1%～3%。在过滤和澄清操作中，酶制剂、明胶和硅藻土的使用也可去除大部分酵母。过滤除菌根据果蔬汁浑浊的程度和性质选择，果蔬汁经过两次以上的过滤可以达到无菌状态。
可是，果蔬汁产品最终达到无菌状态的方法，目前仍普遍采用加热杀菌，因此果蔬汁灌装前或灌装密封后要进行加热杀菌。在生产果蔬浓缩汁时，多数场合下，果蔬汁应在酶处理前进行巴氏杀菌，有时巴氏杀菌与香气回收同时进行。这与果蔬榨汁前的加热，其目的有所不同。
1．加热灭酶
榨汁前对果浆的加热处理是为了灭酶，防止加工中发酵变色和发生其他反应，同时使破碎的果蔬组织软化，提高出汁率。
果汁本身含有各种酶，加工中有时为了澄清目的还向果蔬中添加果胶酶等，在酶作用后都要通过加热使之失去活性。浑浊的果蔬汁只有通过加热才能获得稳定，保持其浑浊状态。果蔬汁稳定的浑浊状态是由果胶形成的，如果果胶被天然酶所分解，果浆颗粒就会凝聚，果汁变澄清。因此加热灭酶对保持果蔬汁稳定性极为重要。
果蔬榨汁前的加热详见本节二(二)内容。
2．加热杀菌
加热杀菌的目的是使果蔬汁中的微生物，特别是酵母和霉菌致死，保证果蔬汁在加工过程中不变质，同时提高果蔬汁产品的保藏性。果蔬汁产品的加热杀菌一般置于灌装密封前，为了防止非无菌灌装过程中发生的微生物二次污染，有时还应根据产品品种和需要进行二次杀菌，所有这些加热都是为了保持果蔬汁产品的无菌状态。
根据杀菌条件的不同，加热杀菌分为巴氏杀菌(低温杀菌)和高温杀菌(瞬时杀菌)。
加热温度的选择原来是以灭酶为目标的，果蔬汁中耐热性强的果胶酶在90℃以上温度才能失去活性，而微生物除特殊种类外，一般在90℃以下温度就可致死。霉菌，特别是霉菌孢子的耐热性大于酵母。加热杀菌温度通常要高于杀菌对象微生物的致死温度，例如柑橘果汁(100%果汁)在85～87．5℃温度下加热2～3s时，残存微生物不会引起罐装果汁的变败。导致浓缩柑橘汁变味(Off flavour)产生奶油味的双乙酰生产菌(乳酸菌之一种)，其耐热性比酵母差，在进入浓缩设备以前经过71．1℃，10s的瞬时加热和冷却就可达到杀菌目的。为了进行生产过程的卫生管理，果蔬汁加工厂应每隔2～3h进行一次双乙酰的测定和微生物镜检。
果蔬汁加热杀菌通常将其加热至规定的杀菌温度，并在此温度下保持规定的杀菌时间。由于果汁pH一般在3．0左右，属于低酸性食品，多采用巴氏杀菌工艺。为了减少加热对果汁质量的影响，可以采用高温短时(HTST)的杀菌工艺。根据果汁品种和需要，果汁的杀菌条件可以在77～93℃温度范围，15～60s时间内进行选定，通常的HTST杀菌工艺是93±2℃、15～30s。
蔬菜汁由于可能污染耐热性强的土壤细菌，而且蔬菜汁的pH较果汁的高，因此杀菌条件比果汁严酷，例如番茄汁在121℃温度至少保温30～40s，胡萝卜、芹菜等需要在121℃温度下保持更长时间。但过高的温度和过长的保温时间可能使蔬菜汁的风味等受到损害，为此有时用有机酸将蔬菜汁的pH调至4．1～4．5范围，使之可以在较低温度下进行杀菌。