家畜布氏杆菌病试管凝集反应操作技术

出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《动物检疫手册》第92页（2678字）

(一)材料准备

1．抗原。使用时用0．5%石炭酸生理盐水作1∶100稀释。凡生霉或出现凝集块的抗原不能应用。

2．受检血清。受检血清必须新鲜，无明显蛋白凝固，无溶血现象和无腐败气味。加入防腐剂的血清自采血之日算起，最迟于十五日内检验。

3．阳性血清。由兽医生物药品厂生产供应，但也可从送检血清中选取，其凝集价最好不低于1∶800。

4．阴性血清。由兽医生物药品厂生产供应。

5．试验用稀释液。石炭酸生理盐水，用化学纯石炭酸5克和化学纯食盐8．5克加至1000毫升蒸馏水中制成，经高压灭菌后备用。

(二)操作方法

1．受检血清的稀释度。一般情况下，牛、马和骆驼用1∶50、1∶100、1∶200和1∶400等4个稀释度；猪、山羊、绵羊和狗用1∶25、1∶50、1∶100和1∶200等4个稀释度。大规模检疫时也可只用两个稀释度即牛、马和骆驼为1∶50和1∶100；猪、山羊、绵羊和狗为1∶25和1∶50。

2．稀释血清(以羊、猪为例)和加入抗原的方法。每份血清用5支小试管(口径8－10毫米)，第1管加入2．3毫升石炭酸生理盐水，第2管不加，第3－4和第5管各加入0．5毫升。用1毫升吸管吸取受检血清0．2毫升，加入第1管中，并混合均匀。混合方法是将该试管中的混合液吸入吸管内，再沿管壁吹入原试管中，如此吸入、吸出3－4次。

混匀后，以该吸管吸取混合液分别加入第2管和第3管，每管0．5毫升。以该吸管将第3管的混合液混匀(方法同前)吸取0．5毫升加入第4管混匀后，又从第4管吸出0．5毫升加入第5管，第5管混匀完毕弃去0．5毫升。如此稀释之后从第2管起血清稀释度分别为1∶12．5，1∶25，1∶50和1∶100。

血清规定用0．5%石炭酸生理盐水稀释，但检验羊血清时用0．5%石炭酸10%盐水溶液稀释。

加入抗原的方法：先以0．5%石炭酸生理盐水，将抗原原液作20倍稀释(如果血清用含0．5%石炭酸10%盐水溶液稀释，则抗原原液亦需用含0．5%石炭酸10%盐水溶液稀释)然后加入上述各管(第1管不加，留作血清蛋白凝集对照)，每管0．5毫升，振摇均匀，加入抗原后，第2－5管各管混合液的容积均为1毫升，血清稀释度从第2管起依次变为1∶25，1∶50，1∶100和1∶200。

综上所述，布氏杆菌病试管凝集反应术式如表2－2所示。

表2－2 布氏杆菌试管凝集反应被检血清稀释法

牛、马和骆驼血清稀释和加抗原的具体方法与上述方法基本相同，不同的是，第1管加2．4毫升0．5%石炭酸生理盐水和0．1毫升受检血清，加抗原以后，从第2－5管血清稀释度为1∶50，1∶100、1∶200和1∶400。

3．对照管的制作。每次试验须作3种对照各一份。

阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。

阳性血清对照：阳性血清对照须稀释到其原有滴度，加抗原的方法与受检血清相同。

抗原对照(了解抗原是否有自凝现象)：加1∶20抗原稀释液0．5毫升于试管中，再加0．5毫升0．5%石炭酸生理盐水(如果血清用含0．5%石炭酸的10%盐水溶液稀释则也加入含0．5%石炭酸的10%盐水溶液)。

4．比浊管的制作。每次试验须配制比浊管作为判定清亮程度(凝集反应程度)的依据，配制方法为取本次试验用的抗原稀释液(即抗原原液20倍稀释液)5－10毫升加入等量的0．5%石炭酸生理盐水(如果血清用0．5%石炭酸的10%盐水溶液稀释，则加入0．5%石炭酸的10%盐水溶液)作对倍稀释，然后按表2－3配制比浊管。

表2－3 标准比浊管的配制法

5．全部试管于充分振荡后，置37－38℃恒温箱中22－24小时，然后检查并记录结果。

6．记录结果。根据各管中上层液体的清亮度，记录凝集反应的强度(凝集价)，特别是50%清亮度(即“++”的凝集)对判定结果关系很大，需用比浊管对照判定。

“#”：完全凝集和沉淀，上层液体100%清亮(即100%菌体下沉)。

“+++”：几乎完全凝集，上层液体75%清亮。

“++”：显着凝集和沉淀，液休50%清亮。

“+”：沉淀明显，液体25%清亮。

“－”：无沉淀，不清亮。

确定每份血清的效价时，应以出现两个“++”以上的凝集现象(即50%的清亮)的最高血清稀释度为血清的凝集价。

(三)结果判定

1．牛、马、骆驼和鹿，1∶100稀释呈“++”或以上时，判为阳性；1∶50稀释呈“++”以上时，判为可疑。

2．绵羊、山羊和猪，1∶50稀释呈“++”或以上时，判为阳性；1∶25稀释呈“++”以上时，判为可疑。

3．对可疑反应的牲畜，经3－4周，必须重新采血检验。