离体培养形态发生过程

出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第26页（10377字）

细胞和组织培养体早期研究，已观察到有组织结构体，但有关植物培养体发育研究，以Skoog和Miller(1957)烟草髓培养体中有关茎叶和根形成的荷尔蒙操作经典工作，以及Steward等(1958)和Reinert(1958，1959)胡萝卜主根体细胞产生不定胚为首创。自此以后，开拓控制这个领域的处理和反应的基本模式：运用一系列培养基转移细胞团；随之产生形态建成，或经器官建成或胚胎发生的发育途径。

随着深入研究这些反应和更多植物种，清楚地看到上述发育的相对简单方式，并不能充分反映出这些实际存在的复杂性。例如，培养中发育途径具有高度可塑性，结果产生模式的更大变异性。这并不是前人研究没有认识到这些论点。相反，早就意识到目前所涉及的问题。可是在培养中激发的形态建成总的热情，和活体和人工培养器官和胚反应上的明显相似性，这些复杂性常被忽视概括。如果对潜在机理有更好认识，鉴别发育中这种可塑性和复杂性是重要的。当今要把植物细胞培养体应用于实际，尤为重要。

本文将论述有关发育模式和变异的意义和重要性。关于导管因素形成，花形成或茎分生组织发育成各种器官如块茎和鳞茎，未加讨论。

(-)基础形态建成反应

过去25年，一般认为培养中的细胞通过器官发生途径，或则生根或则长芽，或经胚胎发生途径产生体细胞或配子胚。培养中的无论何种反映，会令人惊奇。植物发育基础模式之一是在茎分生组织上连续产生不定芽和根上产生侧根。此外，许多植物从其它区域能再生这些不定器官。不定胚是众所周知现象。从未减数大孢子母细胞、胚本身、胚囊中的诸细胞，多数情况从珠心自然地产生胚。这些都是胚珠组织，在培养的植物组织中，从这些细胞曾长成胚。培养中不定胚胎发生的独特概念，是从体细胞或配子细胞产生胚，而在典型的活体上是不会产生的。

在同一组织上，虽曾观察到芽和根或芽、根和体细胞胚，一般认为其产生过程是相互排斥的，即细胞或是进行器官建成或是胚胎发生途径，如果是前者，或产生芽或根。实践中，特定处理通常只产生芽或根或胚，如需要其它器官，必要改变一些条件(例如生根的芽)。同样，许多系统中，如薄层细胞，从同一材料曾启动并非所有形态建成模式。

(二)特殊状态

1．器官建成 培养体中发育的分生组织，最初出现高度细胞质的、局部染色深的细胞，形成芽时，在外植体或愈伤组织边缘，形成根时，常在愈伤组织内部。许多情况下，曾从叶类分生组织的一些细胞群产生分生组织，提出那类结构可能是发育上可塑的，有可能产生芽或根，但未曾证实。

形成分生组织的细胞群，是否起源于单细胞，曾是讨论问题。Steward(1978)基于嵌合体观察，提出顶端分生组织形成，常包括3个或更多细胞的群，可能或不是从单细胞产生的。可是，大多数不定芽中不存在嵌合体或频率极低，以及母株辐射后存在大量实体、非嵌合的突变体，提出它们来自一个细胞。

无论是否来自单细胞，诸细胞群终于组织成分生组织，继续发育成典型芽和根。它们的发育通常与活体不定芽和根相当。与活体产生的状态相似，培养中产生的根和芽有维管束伸展入外植体或愈伤组织。

2．胚胎发生 培养中的体细胞胚，也表现为一组小、细胞质浓细胞；可是，它们的外观常有明显差异，产生高度特殊的细胞群，围以染色深细胞壁。这些细胞群可长成胚，或胚簇，带有格外、次生或附生胚，常在较大、更成熟胚上出现。这种过程在诱导下，这种过程能高度复现。

发育中体细胞胚基部或其周围，如果它埋在组织内的话，是较大、更液泡化细胞。有些体细胞胚基部细胞，有逐步过度成较大细胞。合子胚的类似结构是胚柄。可是，曾普遍否认体细胞胚基部的这些大细胞与胚柄细胞相当。Haccius(1978)认为培养中的体细胞原胚或胚的滋生，类似于裸子植物合子胚中观察到的多胚分割，这种多胚是从原胚性细胞复合体产生。她的解释，合子胚的胚柄是一种发育不全、原胚性细胞复合体。她的见解是二者明显类同，但宁愿保留胚柄一词，无论合子的或非合子的(即体细胞的)，这是“形态上稳定参数”。

一般认为体细胞胚起源于单细胞。最早学者对此产生疑问。曾从单分游离细胞或原生质体看到体细胞胚，但在胚发育前，常是一团细胞状。但是，体细胞胚的组织学研究，如胡萝卜和莴苣悬浮培养物产生的，Dactyhs glomerata叶和Pennisetum等禾谷类切取的胚、叶和花序愈伤组织上发生的，支持着单细胞能产生体细胞胚的观点。

根据下列观察结果，可肯定这种胚是从体细胞的或配子的细胞产生，而不是在一种类分生组织内芽和根的结合在一起。

(1)形态学观察 尤其(a)发育顺序与合子胚所见极为相似，其进程从球形期到心形，鱼雷期和子叶期；(b)开始发育是子叶，不是在芽基部生叶；和(c)形成两极结构，芽在一端，根在另一端。

(2)解剖论据 尤其(a)芽和根端由实体原形成层相连，终于产生维管束组织；和(b)胚根顶端是“闭合的”，即它与愈伤组织的其它细胞无维管束相连。

(3)化学论据 证实了(a)Brassica napus体细胞胚内有胚专化储藏蛋白质；和(b)油棕，Elaeis guineensis经免疫荧光技术检测的胚原培养体的胚专化蛋白质。

所有信息足以信服地反驳最近提出的所有体细胞胚，实质上是芽-根结构，误认为是假胚(Swamy等1981)。可是，有些报导论据不足(形态学、解剖学和生化的)以得出结论，这些已知结构是真实的体细胞胚。

(三)形态建成的开始

目前学者面临的大多数微妙问题，涉及一些条件，把已分化的或在培养中使细胞转向形成不定结构的重新安排，和决定胚胎发生或器官建成、芽或根的途径。本文不加详述。但是，促进培养中形态建成的基本方法，是操作荷尔蒙和环境条件。为了器官建成，改变细胞分裂素和生长素总量和相对量，可能促进非组织愈伤组织生长、形成芽、或根。为了胚胎发生，生长在有足量还原氮和高生长素的培养基，显然对诱导胚性生长(胚胎发生)重要的。保持在高生长素培养基上，这些胚性细胞和原胚产生格外细胞和原胚。降低或不加生长素，明显取得体细胞胚成熟。在这些基本方案上，有许多变化，有许多突出不同操作，曾引起培养中形态建成。不仅有许多种对不同处理发生反应，也很少指出为什么有些种，如此易于产生体细胞胚(如胡萝卜、莴苣，其它伞形科成员)，其它一般产生不定器官(如烟草)，然而少数报告体细胞和小孢子在培养中产生典型胚。

(四)形态建成部位

一般着重报道培养处理导致器官建成或胚胎发生。启动部位和分化较少论及。根据这些研究，指出启动外植体内或继后愈伤组织或细胞悬浮体里不是所有细胞都能形成器官或胚。也不是都对促进形态建成条件相等地发生反应。这些因子使培养中发育模式产生相当大变异。

1．外植体内部位，一个例证 当将胡萝卜叶柄切段，接种在半固体MS基础培养基附加10μM NAA上，可直接形成体细胞胚和植株。即使叶柄是从少数再生植株切取，这些再生植株是同时、同条件、同一组种子产生，在相同处理下，也不是全部叶柄都能形成体细胞胚。任何切段内，只有某些细胞产生植株，并常发生于切段一端(发育的极性的典型例证)。第二种形态建成反应是生根，发生于叶柄的另一端，那些不能进行胚胎发生的切段，可在二端生根。由此可知，任何叶柄切段或其群体，在已知条件下，只有某些细胞具有发育成体细胞胚的竞争能力。

2．竞争性和决定性 植物发育学者们日益增多地采用动物胚胎学者和发育生物学者创立的术语。竞争性是表达遗传潜势能力。即组织内某些细胞有能力长成胚。决定性是这种过程，任何细胞的发育潜势，局限于某种特定途径。诱导性或是特殊细胞竞争性的改变(“直接诱导性”)，或激发竞争性组织的特殊发育反应(“容许诱导性”)。这些术语常难于应用于植物发育。但是，把它们引用于这个领域，反映着近来试图解剖和了解内在机制。可参阅有关评论(Henshaw等，1982；Me Danial，1984；Sussex，1983)。

胡萝卜(Daucus carota)叶柄外植体诱导发育。叶柄切段培养在MS+NAA6周，其一端形成体细胞胚，另一端生根，有些切段只生根。切段经MS+NAA培养1天后，转入无荷尔蒙培养基生长6周，全切段生根。切段培养在MS+2，4-D1天，然后生长在不加荷尔蒙培养基6周，有的一极生体细胞胚，另一极生根，有的只生根。有的一端生根，另一端产生愈伤组织，有些只长愈伤组织。经2，4-D处理3天的切段，只形成愈伤组织。2，4-D处理4天的，有在二极启动了体细胞胚。这些结果不足为奇。由于叶柄作为一种复杂器官，具有诸细胞类型混合体。在外植体内只有某些细胞或组织能产生体细胞胚。叶柄是从许多植株取得的。胡萝卜是异交作物，不经定向杂交，每植株基因型不同。基因型影响培养的植物细胞再生，曾在许多种观察到，如Medicago sativa和Trifolium pratense等。最后，叶柄是在沿轴上的不同部位取得的，也有影响。

3．位置效应 外植体及其产生的细胞形态建成类型和频率，也有赖于其在植株上的原有部位。如Hedera helix幼年和成年茎组织体细胞胚胎发生比较研究，和Nicotiana tabacum茎切段重新形成分生组织研究。许多单子叶培养体，尤其是禾本科(籽粒与草类)，证明了外植体在植株上部位是关键。胚性的，分生组织的(如幼叶)和花序组织比其它部位取得的细胞显示出较大形态建成倾向。可参阅有关评论(Barlow等，1983；McDaniel，1984)。

即使显然相当一致的组织，如烟草表皮撕下的皮，烟草髓外植体或烟草愈伤组织培养体，只有小部分细胞发育成有组织结构。可能是一种组织里只有一些细胞具有随时形成有组织结构的竞争性，或形态建成需要特殊生理条件，和由于组织内诸梯级，愈伤组织内只有特定区域或部位具备那些条件。

Meins等(1982)用培养的烟草组织芽启动数量研究，指出(a)把组织从细胞分裂—生长素培养基转入细胞分裂素培养基以诱导芽形成时，生芽频率很低；(b)当第二次在诱导培养基上诱导生芽时，无芽区域不长芽；和(c)当先生长在加生长素和细胞分裂素完全培养基上，然后转入诱导培养基，无芽区域终于形成芽。外植体中和克隆继代试验中芽分布统计分析指出，生芽频率低，既不是芽形成中心间负互作，也不是缺少具有器官建成潜力的细胞。上述结果可解释为与假说：生芽频率决定于竞争性细胞数或位置效应相一致。但是，非生芽区域经在完全培养基上预处理后，芽的发育，指出细胞对改变荷尔蒙条件的反应而改变其竞争性。

(五)诱导

胡萝卜叶柄有些细胞长成体细胞胚和完整植株的竞争性，不是存在于切取时，而是在无荷尔蒙培养基上诱导过程中产生的。把外植体直接转入无生长调节剂的半固化培养基，不产生愈伤组织或有组织结构。将叶柄接种在诱导培养基(MS+NAA；MS+2，4-D)，每隔天转入无荷尔蒙培养基(MS)，6和12周后观察，那些保持在MS+NAA的产生植株，那些加2，4-D的产生非组织愈伤组织，无可见的体细胞胚。

生长6周后，培养在NAA一天转入无荷尔蒙培养基的，大多数外植体一端生根。在NAA上2，3和4天后再转移的，从每个外植体二端产生大量不定根。但无芽或胚。NAA短时间处理，生长6周后，未能诱导产生体细胞胚胎发生(但是，12周后，可见体细胞胚和植株；对NAA处理1，2，3和4天的反应，分别为0，22，56和67%)。经用2，4-D处理1天的，33%外植体一端发育成体细胞胚和芽，另一端生根，其余一般在一端只生根。2，4-D处理2天的，22%一端生根；另一端出现愈伤组织，处理3天的，未形成根、芽或胚。处理4天后，44%外植体二端生体细胞胚。

显然外植体内至少有二个细胞群体，对诱导处理反应，具有不同时间进程。器官外植体再生期间具有极性是大家知道的当然现象。这些结果指出，每个外植体一端生根，另一端形成体细胞胚。短时间生长素处理，易于诱导根发生，延长2，4-D处理，抑制根形成，这是常见反应。用NAA为生长素，如果要诱导体细胞胚胎发生，只能在一端产生，另一端生根。延长NAA处理(或自后长期诱导培养)是诱导所必需。用2，4-D为生长素，一天诱导，能促进体细胞胚胎发生。但是，延长处理(4天)，是诱导二端产生体细胞胚胎发生所必需的。处理2和3天未见胚形成，提出细胞竞争性的主要变化进行中但未完成。紫苜蓿诱导体细胞胚胎发生研究指出，处理4天是标准处理方式。根发生和胚胎发生竞争性诱导，有赖于外植体的区域，荷尔蒙类型，和荷尔蒙处理时间长度。

研究Convolvulus arvenis叶外植体的芽器官建成，Christianson和Warnick(1984)证实了诱导过程包括对下列抑制剂的敏感性的至少5种不同处理：三碘苯甲酸、山梨醇、核糖、铵离子和乙酰水杨酸。由此可知，这种系统的芽形成诱导过程已开始分成一系列具体步骤。

这些观察增强着这种概念，培养中形态建成，受内在和外在变值二者的顺序改变的直接影响，荷尔蒙培养基是有效影响发育模式的外在因子之一。日益明了为了促进形态建成难的培养体的发育，和对能以掌握的事例能更好地控制其发育，或将要求改变更为复杂的顺序。

(六)形态建成和发育：体细胞胚胎发生

几年来培养中体细胞胚胎发生研究进展巨大，部分由于植物细胞培养应用于农业和农业综合性企业增加。体细胞胚比通过器官建成再生植株有某些优点(Amirota，1983)。由于它们是两极结构，每极带有芽和根尖，都具有植株生长所需分生组织。此外，体细胞胚能大量产生，细胞分散度好，因此适用于生物发生器技术学和机械操作，包括机械转送。作为永久性自然器官，能使胚休眠，制成人工种子后，便于储藏和运输。

1．发育外部模式：形态学 早期研究虽常强调体细胞胚胎发生产生的体细胞胚与合子胚相似性，深入研究指出一些明显差异，和体细胞胚成熟模式的差异性。

(1)未熟发育 大多数体细胞胚，与其合子胚相反，当胚原成熟完成后，并不停止发育，但继续形成再生植株。如胡萝卜体细胞胚发育产生胚根和子叶。植株快速生长和伸长，能造成实际问题，如伸长的根易缠结，使分开、转移或移植困难。许多情况下，这些胚能未熟发芽，产生胚发育受阻或不正常胚。离体合子胚也有发生。

(2)不正常发育 测验体细胞胚群体时，有一系列不正常形式。其中许多是发育的或后生遗传的，而不是遗传改变，由于胚胎发育脱离了正常途径结果。如黄蒿体细胞胚胚根未能长出，下胚轴和子叶未伸长等。它们能长成正常植株。但是这些反常结构会造成如下问题：

①多胚：大多数体细胞胚群体中，可看双生胚或多胚。每个部分是具有根和芽尖的完全胚，但胚轴的局部常连合或畸形。可见带有2或更多芽的单胚。大胚的下胚轴区域、子叶、或胚根上可见较小胚。培养中胚胎发生是重复发生的，胚生胚。如在发生于发育早期，产生双生胚或多胚；稍后形成2芽胚或“双头”形式。如胡萝卜体细胞胚出现单胚，双生胚，二头胚和多胚。沿着发育中胚的侧面启动新胚，结果产生附生胚或次生胚。如黄蒿体细胞胚围绕单个双子叶胚出现一些反常形式，如多子叶，多胚，和沿主轴许多附生胚。多胚或多芽可为意图取得单株目的造成困难。对许多作物是关键问题，如多冠胡萝卜植株会产生生长差的主根。

②畸形芽：许多胚形成芽出现反常性，包括无子叶，子叶过少或过多，或子叶连合，如黄蒿如(a)节所述。子叶基部也会不产生芽分生组织。那些胚常不能发育成株。

③未熟出芽(茎叶)：也曾看到子叶发育不全的体细胞胚，或完全无子叶，和芽尖伸长形成第一片成熟叶。凡此常发生于合理高水平细胞分裂素中。从愈伤组织形成的芽比合子胚的更有可能形成这类结构。正常胚性发育可能在芽形成结果有如此差异，提出培养中器官建成是体细胞胚胎发生的一种形式，即当细胞处于诱导中时，变成有能力发育成胚或分生组织，和有赖于其它因子以决定其最后途径。这是目前讨论中的概念。另一观念，胚胎发生和器官建成竞争性，是不同状态(Henshaw等，1982)。但是，体细胞胚群体的可塑性和其对外界条件的反应性，清楚地指出可能取得胚胎发生悬浮培养体，但未能给以适当条件，供其胚成熟之需。

(3)种间差异 比较伞形科胡萝卜和黄蒿的体细胞胚胎发生，可见即使同科内密切相关的成员，胚成熟模式可有不同。例如生长条件相同和培养技术相同的胡萝卜和黄蒿。胡萝卜体细胞胚在培养中很快发芽(或转变)，长成长胚根，伸长的绿色子叶(光下)，附生胚频率低。相反，黄蒿体细胞胚，并未伸长，胚根未长出，子叶较短，几无绿色。附生胚多。胡萝卜胚成熟模式与莴苣和回香相似，而黄蒿则更类似于水欧洲防风，虽有微妙差异。为什么会产生不同模式，尚属不知。但是，一种印象，是促进和控制发育的诸处理，种与种间可望有所不同，即使仅仅是生长调节剂用量不同，而不是这种物质本身的影响。

(4)改变发育模式因子早期研究培养中离体合子胚，证实了胚成熟能因改变各种培养的和环境因子而显着改变。同样操作曾应用于体细胞胚群体，包括还原氮、其它无机营养，碳水化合物，各种生长调节剂，光、暗、和培养方法(Amirato，1983)。一些有强烈影响的因子述之如下。

①提高渗透性：增高蔗糖水平或加六碳糖醇如肌醇或山梨醇以增高培养基渗透压，可相当大的抑制胡萝卜和水欧洲防风体细胞胚的未熟发芽。产生的子叶短和肉质化，更像合子胚所见，和生长于高蔗糖的胚，抑制花青素形成。这些体细胞胚确有增高形成附生胚频率倾向。近年来，常用增加蔗糖含量以加高渗透性，以利于取得体细胞胚和改变合成途径，如Theobroma cacao体细胞胚的脂肪酸成分。

②脱落酸(ABA)：Ammirato(1974，1977)用不完全抑制黄蒿培养体生长和发育的ABA浓度培养，能选择性地制度某些方面的体细胞胚发育。胡萝卜(Ammirato，1983)也取得相似反应。ABA的影响表示在(a)阻止未熟发芽，(b)抑制沿着胚轴形成附生胚，和(c)增高子叶正常胚频率。ABA选择性地促进正常体细胞胚成熟。在原胚开始进行各种胚性时期时，用ABA处理，结果正常双子叶胚百分率高(90%以上)。把充分发育胚保持在ABA上，能有效地保持胚的静止状态。除去ABA，胚生长成株。在有ABA培养基上生长的胚，比无ABA的，更象正常合子胚。黄蒿体细胞胚，在大小和子叶与胚根相对比例上，很像它们的合子胚伙伴；胡萝卜体细胞胚的子叶发育较差。

2．发育内部模式：解剖学 早期体细胞胚胎发生研究报道，体细胞和合子胚内部结构很相似，但也指出某些差异。体细胞胚的典型特征：(a)无发育良好的表皮层，在培养液中剥落；(b)大多数细胞未熟液泡化，尤其是皮层区域；和(c)未熟细胞分化，尤其是维管束组织(Nessler，1982；Tassarat等，1980)。

黄蒿开始发芽2天的合子胚的纵剖面，可看出已开始液泡化和细胞增大，大多数细胞仍小和细胞质浓。细胞成行排列，可见是有规律发育结果。无成熟、分化的细胞。

生长在无荷尔蒙培养基上的黄蒿体细胞胚，虽与合子胚大小相似，但表现出体细胞胚的典型解剖上的变化。细胞广泛增大，尤以皮层为最，随之细胞排列扭曲，表皮层不完整，有些细胞剥落。其它分裂，偶有形成小原胚。有成熟维管束组织导管成分。胚根端有大量组织，由此发育成若干格外体细胞胚。

生长在加0．1μM ABA培养基的黄蒿体细胞胚，不仅表现正常外表形态，内部解剖特征也与合子胚相似。细胞较小，高度细胞质化，细胞明显直线成排。表皮层完整，虽能见到一些分裂，无附生胚。无成熟导管因素，原形成层虽然明显。胚基部类胚柄细胞生长差，未形成格外胚。ABA不仅促进细胞成熟，更象合子胚。

ABA改变胚性细胞分化模式，也使之改变生化特性。切取Brassica napus未成熟合子胚时，胚专化储藏蛋白质水平降低，除非有ABA存在。这些胚专化储藏蛋白质也能在B．napus体细胞胚中测得，但其水平比成熟合子水平低10倍。体细胞胚与合子胚虽很相似，但在形态和解剖上有相当大差异，可能在某些条件下产生。产生最正常体细胞胚发育模式的条件，有可能产生最相似生化模式。

(七)展望

组织培养中植物发育的深入研究，重新肯定了器官建成和体细胞胚胎发生的基本模式，和促进其形成的因子，以及增进了对其固有复杂性的了解。竞争性、决定性和诱导性观点，正在应用于剖析导致发育的多步骤过程。位置效应揭示着这些过程是如何展开的。发育是可塑的，促进发育过程有所不同或典型化，产生各种模式。目前，不充分了解这些系统是如何可变的，或培养中体细胞胚发育能调整到什么程度。但是，重要性在于注意到发育的可塑性和模式的变异，如果我们要了解和应用这些现象的话。

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