色氨酸的测定

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第130页（2754字）

方法一：对二甲基氨基苯甲醛法测定色氨酸含量

该法是不必进行蛋白质水解的色氨酸直接测定法。

色氨酸能与对二甲基氨基苯甲醛试剂反应生成蓝色产物，其蓝色的深浅与色氨酸的量成线性关系，因此可以利用作为定量测定之用。测定范围为色氨酸10～100微克。

试剂

(1)21．4N H₂SO₄：148毫升浓H₂SO₄加水稀释至250毫升。

(2)对二甲基氨基苯甲醛溶液：600毫克对二甲基氨基苯甲醛溶于180毫升21．4N H₂SO₄中，溶液浓度达到15毫克／4．5毫升。

(3)1%NaNO₂：500毫克NaNO₂加水至50毫升。

(4)0．04%NaNO₂：取1%NaNO₂4毫升加水至100毫升。

(5)色氨酸标准液：10毫克色氨酸加少量蒸馏水，再加1～2滴H₂SO₄使其完全溶解，稀释至100毫升，浓度为100微克／毫升。

操作步骤

1．标准曲线的制备：

(1)按表8于试管中分别加入试剂

表8 标准曲线制备中各种不同试剂的加入量

(2)混匀，蔽光室温下放置1．5小时。

(3)各加0．05毫升0．04%NaNO₂溶液，摇匀，放置30分钟。

(4)以第一管作为空白对照，于600nm处测定光密度值。

(5)以色氨酸微克数为横坐标，O．D₆₀₀为纵坐标绘制色氨酸标准曲线。

2．样品的制备与测定 称0．5克脱脂谷物样品，加入0．25%氢氧化钠溶液10毫升，在40℃水浴中振荡30分钟，或在室温下放置8～15小时，再摇动半分钟，静置使其澄清或3000转／分离心10分钟。

取样品提取液0．25毫升，加蒸馏水0．25毫升，再加4．5毫升对二甲基氨基苯甲醛溶液，按制备标准曲线操作，测定其光密度值。

3．计算

式中：W：样品重(克)

A：从标准曲线中查得样品提取液中色氨酸含量(微克)。

方法二：荧光法测定色氨酸含量

蛋白质经碱水解后，溶液中的色氨酸在甲醛和含铁离子的三氯乙酸作用生成哈尔满化合物。在荧光条件下具有特定的吸收波长，可以定量测定，色氨酸含量在0～10毫微克分子范围内和相对荧光符合直线关系。

试剂

(1)6．25N氢氧化钠溶液：称取125克氢氧化钠，用水溶解并定容至500毫升。

(2)0．1N氢氧化钠溶液：溶解2克NaOH，并定容至500毫升。

(3)4NHCl溶液：取100毫升浓盐酸用水稀释至300毫升。

(4)10%三氯醋酸溶液：称100克三氯乙酸用水溶解并定容至1000毫升。

(5)0．3毫摩尔／升三氯化铁——三氯乙酸溶液：称三氯化铁(FeCl₃·6H₂O)40．5480毫克，加入10%的三氯化铁溶解后，再用10%的三氯化铁稀释至500毫升。

(6)1．8%甲醛溶液：取30%甲醛溶液10．9毫升，用水定容至200毫升。

(7)色氨酸标准溶液：称10毫克色氨酸，用2毫升0．1NNaOH溶液溶解于100毫升棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，此溶液每毫升含100微克的色氨酸标准溶液。使用时用水配制成每毫升相当于1微克的标准溶液。

操作步骤

1．标准曲线的绘制：准确吸取每毫升相当于1微克的色氨酸标准溶液0．0，0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，和5毫升于10毫升容量瓶中，分别加入0．2毫升1．8%甲醛溶液和2毫升含0．3毫摩尔／升的三氯化铁——三氯乙酸混合液。摇匀后于100℃水浴中加热1小时，取出冷却后用水定容至10毫升。

用荧光分光光度计测定其荧光强度，并绘制标准曲线。荧光工作条件为：①激发波长365nm，②发射波长449nm，③激发狭缝3，④发射狭缝3，⑤灵敏度3～5。

2．样品测定：称磨细样品100～200毫克于离心管中，加入4毫升乙醚，摇匀后过夜，然后以3000转／分离心10分钟，将乙醚提取液移入试管内，并用乙醚洗涤残渣三次，合并乙醚液于试管中，在40℃水浴中去除乙醚，残留物中加入4毫升6．25NNaOH溶液，封口，于110℃水解24小时。水解物用4NHCl调节pH6～8，后用水定容至50毫升，过滤，取滤液0．2毫升，加入0．2毫升1．8%甲醛溶液和2毫升0．3毫摩尔／升三氯化铁——三氯乙酸溶液，以下步骤按标准曲线绘制方法进行，测得荧光强度，并从标准曲线中查得样品中色氨酸含量。

3．计算：

式中：C：从标准曲线中查出相当于色氨酸含量(μg)；

W：测定时相当于样品重量(mg)。