斐林试剂比色法测定还原糖含量

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第76页（1151字）

斐林(Fehling)试剂，为便于长期保存，分成两部分配制，即斐林溶液A(只含硫酸酮)与斐林溶液B(含有酒石酸钾钠与氢氧化钠)临用前等体积混合。硫酸酮与氢氧化钠作用生成天蓝色的氢氧化铜沉淀。而酒石酸钾钠在碱性溶液中使氢氧化铜溶解生成复杂的络合物。

单糖和多糖的水解物都含有醛基或酮基，在碱性条件下煮沸能使斐林试剂中的二价铜离子还原为一价的氧化亚铜，而使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比。

本法测定范围在0．1～0．5毫克／毫升还原糖，测定误差为±0．02%，如果含糖量超过测定范围，误差显着增大。

试剂

(1)斐林试剂A：称取40克CuSO4·5H₂O溶解于蒸馏水并定容至1升。

(2)斐林试剂B：称取酒石酸钾钠(C₄H₄O₆KNa·4H₂O)与150克氢氧化钠溶于蒸馏水并定容至1升。

在使用前根据需要量，等体积混合。

(3)0．1%葡萄糖标准溶液：称取0．1克葡萄糖(在105℃干燥2小时)加蒸馏水溶解并定容至100毫升。

操作步骤

1．标准曲线的制作：取7支试管，分别加入0．1%葡萄糖标准液0，1，2，3，4，5，6毫升，并用蒸馏水补足到6毫升，每管含葡萄糖各为0，1，2，3，4，5，6毫克，分别在各管中加入4毫升斐林试剂，混和后，在试管口用玻璃球盖好，放入沸水浴加热15分钟，取出后在流水中冷却，再经1500转／分离心5分钟，取上清液在590nm处进行比色测定，以蒸馏水作比色时的对照，测定含不同浓度糖的各管的光密度值和空白管的光密度值。然后把空白管的光密度值减去各管不同浓度糖的光密度值，并以此差值作纵坐标，各相对的糖含量作横坐标，绘制标准曲线。

2．还原糖的测定：取1毫升待测样品液用蒸馏水补足至6毫升(适当稀释至0．5毫克／毫升左右还原糖量)，加4毫升斐林试剂并和标准曲线同样操作，在590nm处测定光密度值。减去空白管(不含糖)的光密度值。根据此差值，在标准曲线上查出糖含量。

3．计算：

式中：A：标准曲线上查得待测液糖含量(毫克)。